El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.
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Artículo de método
Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero
En este artículo
Resumen
Resumen
Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron utilizando un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado en un sistema de cultivo de botella de laminación oxigenada. Los embriones de ratón en E10.5 fueron cuidadosamente aislados del útero con saco vitelino intacto y en un proceso que implica la maniobra quirúrgica precisa los embriones se exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la continuidad vascular del embrión con el saco vitelino. En comparación con los embriones preparados con saco vitelino intacto o con el saco vitelino se eliminan, estos embriones exhiben tasa de supervivencia superior y la progresión del desarrollo cuando se cultivan en condiciones similares. Se demuestra que estos embriones de ratón, cuando se cultivan en un medio definido en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C durante 16-40 horas, muestran un crecimiento y desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. Creemos thes el método será útil para los investigadores que necesitan para utilizar el cultivo de embriones conjunto para estudiar las interacciones de señalización importantes en la organogénesis embrionaria.
Introducción
In vitro, utilizando métodos de cultivo de embriones en su conjunto son muy adecuados para estudiar los mecanismos involucrados en la organogénesis embrionaria que son difíciles de acceder en el útero de señalización. Embriones enteros proporcionan la integridad de los tejidos y el apoyo adecuados para las interacciones de tejidos que son cruciales para la aparición oportuna de los mecanismos esenciales de señalización para diferentes procesos celulares durante la organogénesis. Mientras que los cultivos de embriones enteros proporcionan una plataforma para una gran cantidad de aplicaciones, tales como estudios de trasplante, las manipulaci....
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Protocolo
Ratón cultivo de embriones:
Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud siguiendo el protocolo # A2010 07-119, el cual fue revisado y aprobado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión, que mantiene continua supervisión regulatoria.
1. Preparación de medios de cultivo
- Preparar medio de cultivo utilizando los medios de comunicación y suplementos de células madre disponibles en el mercado en las siguientes cantidades: Maravilla DMEM, Reemplazo golpe de gracia suero (KSR) (10%), N-2 del Suplemen....
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Resultados
Desarrollo de embriones de ratón depende fuera del útero de múltiples factores a partir de la hora del útero está aislado del cuerpo a la vez que los embriones se cultivan. Como se representa en la Figura 1, el procedimiento implica una serie de etapas que incluyen, la separación del útero grávido del cuerpo (Figura 1A), el aislamiento de los embriones con saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorización de los embriones desde el saco vitelino ( Figur.......
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Discusión
Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. El desarrollo del embrión fuera del útero era críticamente dependientes de varios factores en cada paso durante el procedimiento desde el momento en el útero se aisló a partir de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura (Figura 1). El factor más importante que influyó en .......
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Divulgaciones
Nosotros no tenemos intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Julie Gordon y el Dr. Nancy Manley por sus consejos útiles con la técnica de cultivo. Este trabajo ha sido apoyado por la Fundación del Niño Glaucoma y Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Reemplazo | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Suplemento | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albúmina, de Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiótico - Solución Antimicótica | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicilina (10.000 UI/ml); Estreptomicina (10.000 y micro; g/ml; Anfotericina (250 y micro; g/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Unidad de incubadora de precisión | B.T.C. Engineering Milton Cambridge, Inglaterra | Id.No. 840-374 | |
| botellas de vidrio para unidad giratoria | B.T.C. Engineering | ||
| Silicona Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 cilindro | AirGas Inc. | ||
| Microscopio de disección Stemi SV11 Apo Microscopio | Zeiss | ||
| Stemi SV6 | Zeiss | ||
| CO2 Incubadora con camisa | de agua Forma | Scientific Modelo: 3110 | |
| Campana de cultivo | Cabinas de seguridad biológica Nuaire Clase II TipoA2 | Modelo: Nu-425-600 | |
| Baño de agua | Fisher Scientific | Balanza de pesaje IsoTemp205 | |
| Mettler Toledo | AG285 | ||
| Tubo de centrífuga, 50 ml | Tijeras de operación ligeras Corning | 430291 | |
| Tijeras de operación | Roboz | RS-6702 | |
| Tijeras de operación afiladas-romas | Roboz | RS-6812 | |
| 4 pulgadas | Pinzas | Roboz RS-5211 | |
| - Hudson (cWALD), 4-3/4 pulgadas | Roboz | RS-5237 | |
| (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modificado - Las puntas afiladas se hicieron romas |
| Pinzas de microdisección (5) | Roboz | RS-5060 | Modificado - Las puntas afiladas se hicieron romas |
| Pinzas de microdisección (55) | Roboz | RS-5063 | Modificado - Las puntas afiladas se hicieron romas |
| Bandeja de instrumentos | Roboz | RT-1401S | |
| Tapa de la bandeja de instrumentos | Roboz | RT-1401L | |
| Placa de Petri-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Placa de Petri-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Placa de Petri-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Sistema de filtro ( 0.22 y micro; m Acetato de celulosa)-150 ml | de filtro Corning | 431153 | |
| (0,22 y micro; m Acetato de celulosa)-250 ml | de filtro Corning | 430756 | |
| (0,22 y micro; m Acetato de celulosa)-500 ml | Pipeta Corning | 430758 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Pipeta serológica-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Pipeta serológica desechable-25 ml | Pipeta de transferencia Corning | 4251 | |
| - 7,7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Referencias
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E.
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Reimpresiones y permisos
