Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados.
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Artículo de método
Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus
En este artículo
Resumen
Resumen
Identificar potenciales antivirales contra BTV, hemos desarrollado, optimizado y validado tres ensayos que aquí se presentan. El ensayo basado en CPE fue el primer ensayo desarrollado para evaluar si un compuesto mostró ninguna eficacia antiviral y se han utilizado para cribar gran biblioteca de compuestos. Mientras tanto, la citotoxicidad de los antivíricos también podría ser evaluado usando el ensayo basado en CPE. El ensayo de dosis-respuesta fue diseñado para determinar el rango de eficacia para el antiviral seleccionado, es decir, la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva (CE 50), así como su gama de citotoxicidad (CC 50). El ensayo ToAs fue empleado para el estudio inicial el Ministerio de Agricultura para determinar el mecanismo subyacente de los nuevos antivirales durante BTV ciclo de vida viral o el posible efecto en la maquinaria celular del huésped. Estos ensayos son de vital importancia para la evaluación de la eficacia antiviral en el sistema de cultivo de células, y se han utilizado para nuestras investigaciones recientes conducirción a la identificación de una serie de nuevos antivirales contra BTV.
Introducción
BTV es un virus ARN de cadena doble-prototipo en el género Orbivirus, familia Reoviridae. BTV es una de las enfermedades más importantes de los animales domésticos, incluyendo ovejas, cabras, ganado y otros animales domésticos, con la pérdida de $ 3 mil millones / año en todo el mundo 1,2. La exótica serotipo BTV es un patógeno animal importante que aparece en el "USDA Alta Consecuencia Ganado patógenos." Recientemente, la re-emergente de BTV ha causado un brote importante de la enfermedad en el ganado vacuno y ovino en varios países de todo el norte de Europa 3,4. Como resultado de su importancia económica y como un sistema mo....
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Protocolo
1. Células, Virus y el antiviral compuestos
- Mantener células BSR, un derivado de riñón de hámster bebé (células BHK) 10, en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera fetal al 5% (FCS), 100 U de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Para los tres ensayos, las células de la placa en DMEM con 1% de FCS, 100 U de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, como optimizado previamente 5. Este medio se conoce como medio de ensayo para todos los tres ensayos.
- Incubar todas las células en la incubadora a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad.
- La placa-purific....
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Resultados
1. Eficacia antiviral del compuesto
El ensayo CPE basado en células fue desarrollado, optimizado y validado in vitro utilizando el kit de CTG a base de luminiscente para identificar nuevos antivirales contra BTV como se ha descrito previamente 2,5. El ensayo de respuesta de diez dosis fue empleado para reflejar la eficacia antiviral y la citotoxicidad de un compuesto de plomo identificado por la medición del número de células metabólicamente viables en cultivo basad.......
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Discusión
Para la identificación inicial de los accesos antivirales, uno de los pasos principales para el descubrimiento y desarrollo de fármacos antivirales es para desarrollar ensayos robustos, que incluye la selección de un marcador cuantificable, el desarrollo de un protocolo simple, la obtención de señales suficientes y menos de 10% de CV. La mayoría de las pantallas bioquímicos o basados en células están diseñados para proporcionar un punto de partida química basado en el, ensayo simple y de bajo costo más robusto, debido.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este proyecto fue apoyado por el subsidio 1R03MH08127-01 y 7R03MH08127-02 de los NIH para P. Li, y por los fondos de IMPACTO del Departamento de Medicina de la UAB a Q. Li. El apoyo del Fondo Molette y la Universidad de Auburn es apreciado. También agradecemos a las asistencias técnicas de la Sra. Pulin Che y el Sr. Volodymyr Musiienko durante el transcurso de la obra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio DMEM | Gibco | 1134218 | Para cultivo celular |
| FBS | Gibco | 16000044 | Para cultivo celular |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Gibco | 1000185 | Para cultivo celular |
| DPBS | Gbico | 1049769 | Para cultivo celular |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | Para la medición de la viabilidad celular |
| 70% etanol | Fisher | S25309B | Diluido a partir del 95% |
| Compuestos antivirales de huashil | NIH MLSMR y síntesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| Célula BSR | Desarrollado internamente | ||
| Lector de microplacas multimodo Synergy-II | BioTek | Para la lectura de señales luminiscentes | |
| Dispensador | de selección MicroFloBioTek | Adición de células, virus y reactivos | |
| Microplaca de fondo plano de 384 pocillos | CORNING | 28908031 | Para cultivo celular |
| Software Gen. 5 | BioTek | Para el análisis de las salidas de lectura del lector de microplacas multimodo Synergy-II | |
| GraphPad Prisma 5 | GraphPad | versión 5 | Para análisis biostáticos y gráficos |
Referencias
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
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Reimpresiones y permisos
