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Artículo de método

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

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DOI:

10.3791/50820

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11 de octubre de 2013

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

En este artículo

Resumen

Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados.

Resumen

Identificar potenciales antivirales contra BTV, hemos desarrollado, optimizado y validado tres ensayos que aquí se presentan. El ensayo basado en CPE fue el primer ensayo desarrollado para evaluar si un compuesto mostró ninguna eficacia antiviral y se han utilizado para cribar gran biblioteca de compuestos. Mientras tanto, la citotoxicidad de los antivíricos también podría ser evaluado usando el ensayo basado en CPE. El ensayo de dosis-respuesta fue diseñado para determinar el rango de eficacia para el antiviral seleccionado, es decir, la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva (CE 50), así como su gama de citotoxicidad (CC 50). El ensayo ToAs fue empleado para el estudio inicial el Ministerio de Agricultura para determinar el mecanismo subyacente de los nuevos antivirales durante BTV ciclo de vida viral o el posible efecto en la maquinaria celular del huésped. Estos ensayos son de vital importancia para la evaluación de la eficacia antiviral en el sistema de cultivo de células, y se han utilizado para nuestras investigaciones recientes conducirción a la identificación de una serie de nuevos antivirales contra BTV.

Introducción

BTV es un virus ARN de cadena doble-prototipo en el género Orbivirus, familia Reoviridae. BTV es una de las enfermedades más importantes de los animales domésticos, incluyendo ovejas, cabras, ganado y otros animales domésticos, con la pérdida de $ 3 mil millones / año en todo el mundo 1,2. La exótica serotipo BTV es un patógeno animal importante que aparece en el "USDA Alta Consecuencia Ganado patógenos." Recientemente, la re-emergente de BTV ha causado un brote importante de la enfermedad en el ganado vacuno y ovino en varios países de todo el norte de Europa 3,4. Como resultado de su importancia económica y como un sistema modelo, BTV ha sido objeto de extensos estudios moleculares, genéticos y estructurales, y varios se han desarrollado vacunas. Sin embargo, debido a la falta de ensayos adecuados para el descubrimiento de fármacos antivirales, no hay antivirales disponibles contra BTV.

En una selección de alto rendimiento reciente campaña (HTS) usando BTV como el sistema modelo, developed, optimizado y validado un ensayo basado en CPE para identificar potenciales antivirales de amplio espectro contra los arbovirus 5. Ensayo basado-CPE es un ensayo bien reconocido que se ha utilizado en el descubrimiento de fármacos antivirales contra un número de virus que induce una rápida y observables CPE / apoptosis 5-7. En nuestro sistema, después de la infección BTV, el ECP es evidente en las células de vertebrados, incluyendo células HeLa, BSR, y HEK 293T 8. CPE inducida por BTV podría controlarse y cuantificarse utilizando diversos métodos de detección de la viabilidad celular, incluyendo el kit de reactivo de la viabilidad celular CellTiter Glo (kit de CTG) 9. Este kit determina el número de células viables en cultivo basado en la cuantificación del ATP celular presentado, que señala la presencia de células vivas metabólicamente activas. En condiciones optimizadas, el ensayo basado en CPE que aquí se presenta mostró su viabilidad con la "mezclar y medir" protocolo de un paso, y la flexibilidad con señales luminiscentes estables. Mientras tanto, los compuestos tóxicos Reducing la viabilidad celular se puede excluir en este ensayo basado en CPE. El ensayo basado en CPE mostró su robustez y fiabilidad para el descubrimiento de fármacos antivirales contra BTV, y se ha utilizado para detectar el NIH bibliotecas moleculares de moléculas pequeñas Repositorio (MLSMR), que conduce a la identificación de seis clúster novela de potencial compuesto de plomo antiviral (s ) 5.

Cuando un compuesto antiviral potencial ha sido identificado utilizando el ensayo basado en CPE, que tendrá que ser sometido al ensayo de dosis-respuesta de diez concentración para determinar el rango de eficacia antiviral y la citotoxicidad 2. La eficacia antiviral, representada como la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva 50% (CE 50), es la concentración de un fármaco que inhibe a mitad de camino de CPE inducido por el virus entre la línea de base y máxima. La citotoxicidad de los antivirales, es decir, la concentración de la citotoxicidad 50% (CC 50), es la concentraciónde un fármaco que induce 50% de citotoxicidad entre la línea de base y máxima. El índice selectivo (SI), que se denota como 50% de Si (SI 50) se calcula a partir de CC 50 / IC 50 que determina la especificidad de la antiviral contra el CPE inducido por el virus. El IC 50 (o CE 50), CC 50 y SI 50 valores son medidas críticas para determinar si un compuesto antiviral es potente y selectivo para el desarrollo de drogas.

Cuando un antiviral no mostró toxicidad manifiesta in vitro, sin embargo, el virus impedido inducida CPE y el ciclo de vida viral productiva, es importante para caracterizar su Ministerio de Agricultura 2. Iniciamos dicha caracterización mediante la realización de ensayo de Toa para determinar el paso posible (s) del ciclo de vida del virus que queda afectada por el antiviral. En general, el compuesto antiviral se añadieron a las células a diferentes tiempos pre-o post-infección de virus. Si se añaden los antivirales a las células infectadas por publicar en su objetivo sTEP durante el curso de la infección, que daría lugar a una menor actividad en comparación con la que se añadió antes de la etapa. Así, el estudio ToAs es fundamental para determinar la eficacia antiviral de un compuesto, y su objetivo potencial, ya sea en el ciclo de vida viral o la maquinaria de acogida que participan en el ciclo de vida viral.

Para los tres ensayos, la viabilidad celular se determinó usando el kit de CTG siguiendo las instrucciones del fabricante 5. Este sistema de detección emite señales de luminiscencia adecuados que podrían ser analizados utilizando distintos programas informáticos en la empresa. Cada ensayo se validó y se realiza al menos por triplicado, con ocho réplicas. Para todos los datos obtenidos, tres parámetros, incluyendo valor medio (AVE), desviación estándar (STDEV), y coeficiente de variación (CV) se analizaron para determinar la robustez del ensayo. Una vez que la robustez del ensayo se ha determinado, serán analizados con mayor detalle los datos y se representan utilizando diversos bioestadística y gráficamenteherramientas de c 2.

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Protocolo

1. Células, Virus y el antiviral compuestos

  1. Mantener células BSR, un derivado de riñón de hámster bebé (células BHK) 10, en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera fetal al 5% (FCS), 100 U de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
  2. Para los tres ensayos, las células de la placa en DMEM con 1% de FCS, 100 U de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, como optimizado previamente 5. Este medio se conoce como medio de ensayo para todos los tres ensayos.
  3. Incubar todas las células en la incubadora a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad.
  4. La placa-purificar y propagar el tipo 10 BTV (BTV-10) como se describió previamente 8. Diluir BTV-10 en medio de ensayo para cada uno de los ensayos designados.
  5. Disolver todos los compuestos de prueba en DMSO para formar una acción con la concentración a 10 mM. Guarde los stocks a -20 ° C.
  6. Diluir compuestos a concentraciones deseadas usando medio de ensayo para el designadod ensayos 2.

2. Ensayo basado en la CPE Utilizando Kit CTG

  1. Semilla células BSR en una microplaca de 384 pocillos (negro, formato de 16 x 24) a través de MicroFlo seleccione dispensador. La densidad de siembra es de 5.000 células / pocillo, y el volumen de siembra es de 20 l para el análisis de eficacia antiviral.
  2. Se incuban las células durante 2-3 horas hasta que las células obtienen adherente a la placa de fondo.
  3. Añadir compuesto antiviral con una concentración final de 10 mM a cada pocillo. Mezcle completamente.
  4. Diluir BTV a título deseado y añadir 5 l BTV con denotado MOI a cada pocillo. Para el control del pozo, añadir 5 l de medio de ensayo. Se incuban las células infectadas durante 72 horas a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad.
  5. En 72 hpi, descongelación y equilibrar tampón CTG CTG y el sustrato liofilizado a temperatura ambiente antes de su uso. Reconstituir la solución homogénea reactivo CTG mezclando el liofilizado de enzima / sustrato y el reactivo tampón de acuerdo con ªe instrucciones del fabricante.
  6. Equilibrar las placas de ensayo a temperatura ambiente durante 15 min.
  7. Añadir un volumen igual (25 l) de reactivos CTG a cada pocillo un dispensador. Después de incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad, medir señales de luminiscencia usando un lector de multi-modo con un tiempo de integración de 0,1 segundos.

3. Ensayo de dosis-respuesta

  1. Seed células BSR en una microplaca de 384 pocillos (negro; formato de 16 x 24) a través de un dispensador, con una densidad de siembra de 5000 células / pocillo en un volumen de siembra de 20 l para el ensayo de eficacia antiviral y 25 l para el ensayo de citotoxicidad, respectivamente .
  2. Se incuban las células durante 2-3 horas a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad hasta que las células son bien unido a la placa.
  3. Proceso de ensayo en una zona de cuarta parte de la placa de 384 pocillos para cada compuesto (equivalente a una placa de 96 pocillos), como se muestra en la Tabla 1. Asignar ocho réplicas para cada concentraciónen un único ensayo. Asignar la primera columna como el control positivo sin la adición de compuesto y el virus, y la última columna (12 ª) como control negativo mediante la adición de virus sólo sin compuestos.
  4. Diluir compuestos a 50 mM en medio de ensayo y añadir a la columna de la 2 ª a 20 l / pocillo para el ensayo de eficacia antiviral. Mezclar el compuesto cinco veces usando 8-canal de pipeta semi-automática a una concentración de 25 mM.
  5. Usando la pipeta semiautomática de 8 canales, transferir 20 mezcla l en la columna 2 ª a la siguiente columna (3 º), mezclar bien hasta formar una concentración de 12,5 mM. Repita este proceso mediante la transferencia de 20 l de mezcla de la columna 3 ª a la siguiente columna (4 ª) para formar otra dilución de dos veces con una concentración de 6,25 mM. Repita esta dilución en serie de dos veces hasta que la columna de la 11 ª. Aspirar y desechar 20 l de la mezcla en la columna 11 º después de añadir y mezclar el borradoround.
  6. Añadir BTV-10, basado en MOI de 0,01, a cada pocillo de la columna 2 a la columna 11 con un volumen de 5 l / pocillo. Después de añadir el virus, la concentración de compuesto final en cada columna debe ser: 20 M en la columna 2, 10 mM en la columna 3, y continuó con una dilución de dos veces a la columna 11 con una concentración final de 0,04 mM.
  7. Añadir 5 l de medio a la columna 1 como célula sólo de control (positivo) y 5 l / pocillo de BTV a la columna 12 como infección por el virus sólo de control (negativo).
  8. Diluir compuestos a una concentración inicial de 200 mM para el ensayo de citotoxicidad. Del mismo modo, añadir 25 l / pocillo de compuesto a la columna 2 y 5x mezclado con pipeta semi-automático de 8 canales a una concentración de 100 mM. No agregue BTV.
  9. Llevar a cabo la dilución serie de dos veces por aspiración 25 l de la columna 2 a la columna vecina 3, y continuó hasta la última columna (12 º). En la columna 12, después de la mezcla, aspirado y desechar 25 l de mezcla. La concentración final en la columna 2 debe ser 100 M y la columna de la 12 ª debe estar en 0,2 mM. La columna 1 es el único control de células.
  10. Para ambos ensayos de eficacia y de citotoxicidad antivirales, incubar las placas a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad durante 72 horas después del tratamiento. Medir la viabilidad celular utilizando el kit de CTG como se describió anteriormente (protocolo de los pasos 2.5 a 2.7).

4. Time-of-Adición (TOA) Ensayo

  1. Células BSR Semilla de la columna 1-24 en una microplaca de 384 pocillos (negro, en formato de 16 x 24) a través de un distribuidor a 5.000 células / pocillo y el volumen de siembra es de 15 l / pocillo.
  2. Para cada compuesto, utilizar todos los veinticuatro columnas con ocho réplicas para cada punto del tiempo en un medio de la placa de 384 pocillos (Tabla 2). Asigne la columna 1 como células único control por adición de 10 l / pocillo de medio de ensayo. Marcar la columna 24 como infección por el virus sólo de control (control negativo) mediante la adición de 5 l / pocillo de medio de ensayo unavirus de D 5 l / pocillo a una MOI de 0,01 a un volumen final de 25 l / pocillo.
  3. Seleccione las columnas de números pares de la columna 2-22 columna de evaluación de la eficacia como antiviral a diferentes horas después de la infección (hpi). En estas columnas, infectar las células con 5 l / pocillo BTV a MOI de 0,01. En diferente hpi, también añadir 5 l / compuesto bien diluida a cada pocillo para formar un volumen final de 25 l / pocillo. Para el denotados -2 y -1 hpi añadir compuesto de células BSR antes de la infección por el virus. Para 0 hpi, añadir el compuesto y BTV a la cultura al mismo tiempo.
  4. En paralelo, designar las columnas impares de la columna 3-23 como compuesto sólo controla, de los cuales el compuesto se añadieron a diferentes puntos de tiempo designado como (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). En estas columnas, se añade medio / pocillo de ensayo 5 l y 5 l / pocillo diluida compuesto para formar un volumen final de 25 l / pocillo.
  5. Después del tratamiento, las células se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 con 80-95% de humedad.
  6. Determinar la viabilidad celular a 72 hpi usando el kit de CellTiter-Glo como se ha descrito previamente (protocolo de los pasos 2.5 a 2.7).

5. Análisis de Datos

  1. Procesar todos los datos primero usando el software adecuado en la empresa sobre la base de las señales luminiscentes obtenidas mediante el lector multi-modo. Determinar el valor medio (Media), desviación estándar (STDEV) para cada tratamiento, así como las variaciones de los coeficientes (CV), que requiere un valor no mayor que 10%.
  2. Transfiera los datos procesados ​​del software anterior a una herramienta de software bioestático y gráfica. Llevar a cabo el análisis de regresión no lineal para determinar los valores de CE 50 y CC 50.

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Resultados

1. Eficacia antiviral del compuesto

El ensayo CPE basado en células fue desarrollado, optimizado y validado in vitro utilizando el kit de CTG a base de luminiscente para identificar nuevos antivirales contra BTV como se ha descrito previamente 2,5. El ensayo de respuesta de diez dosis fue empleado para reflejar la eficacia antiviral y la citotoxicidad de un compuesto de plomo identificado por la medición del número de células metabólicamente viables en cultivo basad...

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Discusión

Para la identificación inicial de los accesos antivirales, uno de los pasos principales para el descubrimiento y desarrollo de fármacos antivirales es para desarrollar ensayos robustos, que incluye la selección de un marcador cuantificable, el desarrollo de un protocolo simple, la obtención de señales suficientes y menos de 10% de CV. La mayoría de las pantallas bioquímicos o basados ​​en células están diseñados para proporcionar un punto de partida química basado en el, ensayo simple y de bajo costo más robusto, debido...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por el subsidio 1R03MH08127-01 y 7R03MH08127-02 de los NIH para P. Li, y por los fondos de IMPACTO del Departamento de Medicina de la UAB a Q. Li. El apoyo del Fondo Molette y la Universidad de Auburn es apreciado. También agradecemos a las asistencias técnicas de la Sra. Pulin Che y el Sr. Volodymyr Musiienko durante el transcurso de la obra.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio DMEMGibco1134218Para cultivo celular
FBSGibco16000044Para cultivo celular
0,05% Tripsina-EDTAGibco1000185Para cultivo celular
DPBSGbico1049769Para cultivo celular
CellTiter-Glo (CTG) kitPromegaTB288Para la medición de la viabilidad celular
70% etanolFisherS25309BDiluido a partir del 95%
Compuestos antivirales de huashilNIH MLSMR y síntesis
BTV-10ATCCVR-187
Célula BSRDesarrollado internamente
Lector de microplacas multimodo Synergy-IIBioTekPara la lectura de señales luminiscentes
Dispensadorde selección MicroFloBioTekAdición de células, virus y reactivos
Microplaca de fondo plano de 384 pocillosCORNING28908031Para cultivo celular
Software Gen. 5BioTekPara el análisis de las salidas de lectura del lector de microplacas multimodo Synergy-II
GraphPad Prisma 5GraphPadversión 5Para análisis biostáticos y gráficos
de novo

Referencias

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

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