Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Resumen

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Resumen

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el miembro prototipo del género Avulavirus de la familia Paramyxoviridae ^1, es una, de sentido negativo no segmentado, de cadena única, envuelto ARN del virus (Figura 1) con aplicaciones potenciales como un vector para la vacunación y tratamiento de enfermedades humanas. Exploración en profundidad de estas aplicaciones sólo ha sido posible después de que el establecimiento de técnicas de genética inversa para rescatar a los virus recombinantes a partir de plásmidos que codifican sus genomas completos como cDNA ^2-5. ADNc viral puede ser convenientemente modificado in vitro mediante el uso de procedimientos de clonación estándar para alterar el genotipo del virus y / o para incluir nuevas unidades de transcripción. Rescate de estos virus modificados genéticamente proporciona una valiosa herramienta para entender los factores que afectan a múltiples etapas de la infección, así como permite el desarrollo y la mejora de los vectores para la expresión y entrega de antígenospara la vacunación y la terapia. Aquí se describe un protocolo para el rescate de NDVs recombinantes.

Introducción

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un paramixovirus aviar perteneciente al género Avulavirus ^1, es un agente zoonótica económicamente relevante y por lo tanto ampliamente investigado y vigilado, que pueden afectar gravemente a la cría de aves en todo el mundo. Aunque no es un patógeno humano, NDV también se ha estudiado a fondo más allá del campo veterinario tanto como un modelo de paramixovirus y debido a sus propiedades altamente interesantes oncolíticos naturales, ^6. Investigación sobre el NDV se benefició en gran medida del desarrollo de técnicas de genética inversa para los virus de una sola cadena, no segmentados de sentid....

Protocolo

1. Preparación de células de mamíferos (Figura 4A, Día 1)

Dividir HEp-2 o células A549 el día antes de la transfección en placas de 6 pocillos. Densidad de las células debe alcanzar el 80-90% de confluencia el día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm plato se puede dividir en 8 pozos (alrededor de 1 x 10 ⁶ células por pocillo). Para cada virus para ser rescatado, 2-4 pozos diferentes deben incluirse, además de 2 pozos adicionales para los controles pCAGGS-GFP y GFP-pCITE ^18, con el objetivo de monitorear la transfección y MVA-T7 eficiencia de infección, respectivamente.

Resultados

Rescate de NDV es un procedimiento bien establecido, realizada de forma rutinaria en los laboratorios que tienen acceso a la ADNc completo del virus. Sin embargo, la naturaleza estocástica intrínseca del método hace que sea difícil de lograr la eficiencia de rescate 100%. El seguimiento de los primeros pasos del proceso, especialmente la eficacia de la transfección y la infección con MVA-T7, ayuda a la identificación de posibles problemas. Figura 5A muestra la transfección estándar y las eficiencias de .......

Discusión

Hay varios factores que deben ser considerados para lograr buenos resultados, mientras que el rescate de NDV. En primer lugar, la construcción de ADNc de longitud completa para ser utilizado tiene que ser diseñado para permitir la incorporación funcional de los nuevos transgenes / modificaciones en el genoma NDV. Esto significa que, como se ha dicho, que las secuencias de (i) de gama apropiada gen (GE), intergénica (IG) y el inicio del gen (GS) se deben añadir, si es necesario, (ii) no hay secuencias de GE o GS putativo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Cualquier proveedor
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Albúmina bovina (BA)	Sigma	232-936-2	Cualquier proveedor
Tripsina-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Cualquier proveedor
Penicilina/Estreptomicina (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Cualquier proveedor
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Cualquier proveedor
Líneas celulares Las células A549 (número de catálogo CRL-185), las células HEp-2 (número de catálogo CRL-185), los fibroblastos de embrión de pollo (número de catálogo CRL-12203) y los fibroblastos de embrión de pato (número de catálogo CCL-141) son disponible en la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Todas las líneas celulares se mantienen en un formato de 37 ° Incubadora C con 5% CO2 en DMEM 10% FBS, 1% PS. Huevos de gallina embrionados Los huevos de gallina embrionados se pueden obtener de Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Productos y servicios aviares (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, EE.UU.) y se mantienen a 37 °C. La viabilidad de los embriones se evalúa con un candelabro de huevos. Los huevos se infectan cuando alcanzan los 8-10 días de edad. Tanto la infección como la recolección del líquido alantoideo tienen lugar en condiciones estériles. Todos los huevos se esterilizan en autoclave y se desechan siguiendo los protocolos estándar de bioseguridad del laboratorio. Turkey (RBC) Turkey RBC se pueden comprar en Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, EE. UU.) y almacenarse a 4 °C. Para preparar glóbulos rojos para el ensayo de AH, lavar 5 ml de caldo comercial con 45 ml de PBS 1x en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar durante 5 min a 1.000 rpm y desechar con cuidado el sobrenadante. Diluya RBC granulado 1:1,000 en PBS 1x para una concentración final de 0.5-1.0%. Los glóbulos rojos lavados se pueden almacenar a 4 & grados; C durante varios días. Plásmidos Las preparaciones de plásmidos se obtienen con cualquier kit de maxiprep disponible en el mercado según el fabricante' instrucciones de trabajo, diluido en ddH20 hasta una concentración final de 1 μ g/μ l y se almacenan a -20 °C. La concentración y pureza del ADN se evalúan mediante espectrofotometría a 260 y 280 nm. Las preparaciones con una relación 260/280 superior a 1,8 se consideran de calidad aceptable para el rescate. La calidad del ADN plasmídico también se verifica de forma rutinaria mediante cromatografía en gel de agarosa. Viruses El protocolo descrito para el rescate de la cepa lentógena Hitchner B1 del NDV se puede realizar en condiciones de nivel de bioseguridad (BSL) 2. La Vaccinia Ankara modificada que expresa la ARN polimerasa T7 (MVA-T7) fue descrita 34 y obtenida del Dr. Bernard Moss. Este virus crece en monocapas confluentes de fibroblastos de embriones de pollo y se titula en células de mamíferos (A549 o HEp-2). Las existencias de NDV se cultivan en huevos de gallina embrionados y se valoran mediante IFA utilizando suero policlonal criado contra viriones purificados. Todo el material contaminado debe esterilizarse y eliminarse de manera segura de acuerdo con los procedimientos estándar de bioseguridad. Medios y soluciones de cultivo de tejidos: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco' s Águila modificada' s Medio (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina (P/S): 445 ml de DMEM, 50 ml de FBS inactivado por calor, 5 ml de solución P/S comercial 100x. Almacenar a 4 °C. 10x Solución salina tamponada con fosfato (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4.7H2O, 2 g de KH2PO4. Agregue ddH2O hasta 1 L. Ajuste el pH a 7.3. Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente. 1x PBS: Diluir 10x PBS 1:10 con ddH2O. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. 100x Ca/Mg: 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O y añadir ddH2O hasta 100 ml. Autoclave y almacenamiento a temperatura ambiente. 1x PBS/BA/PS: 50 ml de 10x Solución salina tamponada con fosfato (PBS) en 437 ml ddH2O. Autoclave y cuando se enfríe a temperatura ambiente, agregue 5 ml 100x Penicilina/Estreptomicina, 3 ml 35% Bovino y 5 ml de 100x Ca/Mg. Almacene a 4 °C.