La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Resumen

Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Resumen

Las uniones gap son canales intercelulares que permiten la comunicación de las células vecinas. Esta comunicación depende de la contribución de un hemicanal por cada célula vecina para formar la unión gap. En las células de mamíferos, el hemicanal está formado por seis conexinas, monómeros con cuatro dominios transmembrana y un terminal C y N dentro del citoplasma. Las uniones gap permiten el intercambio de iones, segundos mensajeros y metabolitos pequeños. Además, tienen un papel importante en muchas formas de comunicación celular dentro de los procesos fisiológicos, como la transmisión sináptica, la contracción del corazón, el crecimiento y la diferenciación celular. Detallamos cómo realizar una microinyección unicelular de Lucifer Yellow para visualizar la comunicación celular a través de uniones gap en células vivas. Se espera que en las uniones de brecha funcional, el tinte se difunda desde la celda cargada a las celdas conectadas. Es una técnica muy útil para estudiar las uniones gap ya que se puede evaluar la difusión de la fluorescencia en tiempo real. Discutimos cómo preparar las células y la micropipeta, cómo usar un micromanipulador e inyectar un colorante fluorescente de bajo peso molecular en una línea celular epitelial.

Introducción

Gap cruces son canales intercelulares que permiten la intercomunicación entre las células vecinas ^1. Esta comunicación se conecta dos o más células vecinas, donde cada uno contribuye con una conexón o hemicanal para formar el canal intercelular. En células de mamíferos, la conexón está formado por seis conexinas, monómeros con cuatro dominios transmembrana y una C y N terminal dentro del citoplasma ^2. Gap cruces no sólo permiten el flujo de iones, segundos mensajeros y pequeños metabolitos, sino que también contribuyen a muchas formas de comunicación celular en muchos procesos fisiológicos, tales como la transmisión sin....

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Mantener un cultivo de una línea celular epitelial del timo (IT76M1) o células a ensayar en una incubadora (37 ° C / 5% de CO _2).
2. Se lavan las células con PBS 1x (repetir este artículo 3x).
3. Añadir tripsina a las células durante 5 min.
4. Añadir medio (dos veces del volumen de tripsina añadida en el punto 1.3) con 10% de FBS (suero bovino fetal) a las células con tripsina y se centrifuga (800 x g durante 5 min).
5. Contar las células en un hemocitómetro.
6. Ajuste la densidad de células de acuerdo con el tipo de célula como las células tienen que estar en estrecho contac....

Resultados

Línea de células epiteliales del timo IT-76MI se utilizaron para evaluar tinte de acoplamiento por uniones comunicantes como se describen estas células para expresar uniones gap funcionales formados por conexinas 43 ^21. La Figura 1 muestra la inyección de Lucifer Yellow cuando se aplica en la célula debajo de la punta de la pipeta. Después de algunos minutos, las células se vuelven conectados fluorescente (asteriscos) que indica la difusión del colorante fluoresce.......

Discusión

Con el fin de verificar la presencia de brecha de la salida intercelular funcional, el uso de trazadores, que son de la membrana impermeable, aunque permeable por canales intercelulares se requieren ^16. Fluoresceína, el primer tinte fluorescente para observar célula a célula de acoplamiento ^22, es permeable entre las membranas no de unión ³ y por lo tanto ha sido sustituido por Lucifer colorante amarillo ^15. En la actualidad,.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lucifer amarillo	Sigma	L0259
Cloruro de litio	Sigma	L4408
PBS tabletas Sigma		P4417
RPMI	Sigma	R4130
Suero fetal bovino	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
mesa con aislamiento de vibraciones	Newport	VH3036W-OPT	Se necesita una mesa aislada de vibraciones para proteger los experimentos de las vibraciones y evitar daños en las células
Micromanipulador	Narishige	MMO-203	Este equipo permite ajustes de precisión de la micropipeta, que es necesaria para la microinyección de células.
Generador de corriente	Digitimer	DS2	Para producir el flujo de tinte a través de la micropipeta, se administró una corriente inferior a un nanoamperio utilizando un generador de corriente con un electrodo dentro de la micropipeta o un amplificador que tiene un circuito de compensación de capacitancia (electrómetro antiguo) o funciones de inyección de corriente de nuevos amplificadores de pinza de parche, y el cable de tierra sumergido en el plato de placa. Alternativamente, el tinte puede ser inyectado por un microinyector neumático, siguiendo las recomendaciones de fábrica.