La microinyección es una técnica común que se utiliza para entregar construcciones de ADN, ARNm, oligonucleótidos antisentido morfolino u otros tratamientos en los huevos, embriones y células de diversas especies.
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Artículo de método
High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos
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Resumen
Resumen
La microinyección en células y embriones es una técnica común que se utiliza para estudiar una amplia gama de procesos biológicos. En este método, una pequeña cantidad de solución de tratamiento se carga en una aguja de microinyección que se utiliza para inyectar físicamente células o embriones individuales inmovilizadas. A pesar de la necesidad de una formación inicial para realizar este procedimiento para la entrega de alto rendimiento, la microinyección ofrece la máxima eficiencia y la entrega reproducible de una amplia variedad de soluciones de tratamiento (incluyendo mezclas complejas de muestras) en las células, los óvulos o embriones. Aplicaciones a las microinyecciones incluyen la entrega de las construcciones de ADN, ARNm, proteínas recombinantes, ganancia de función, y la pérdida de función de los reactivos. Colorante fluorescente o colorimétrico se añade a la solución inyectada para permitir la visualización inmediata de la entrega eficiente, así como una herramienta fiable para la normalización de la cantidad de la solución entregada. El método descrito permite la microinyección de 100-400 erizo de mar zygotes dentro de 10 a 15 min.
Introducción
La aplicación del tratamiento eficiente y reproducible es uno de los principales desafíos metodológicos para los investigadores. Varios métodos han sido establecidos para ofrecer soluciones de tratamiento de forma transitoria en los huevos, embriones y células. Estos métodos incluyen la electroporación (basado en una generación de poros transitorios en la membrana utilizando pulsos eléctricos cortos) 1,2, lipofección (entrega a través de la fusión de liposomas que contiene el tratamiento con la membrana) 1, bombardeo de micropartículas 1 (ADN se precipita en la micrones partículas de tamaño de metal que luego se utilizan para penetrar....
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Protocolo
1. Preparación de protamina sulfato de (PS) Platos Coated
- Preparar la solución de 1% de sulfato de protamina (PS) mediante la adición de 0,5 g de PS a 50 ml de agua desionizada, agua destilada (ddH2O) en un tubo cónico de 50 ml. Agite bien a alta velocidad en un agitador banco a temperatura ambiente durante 1-2 horas para asegurar la disolución completa del PS. Esta solución se puede almacenar a 4 ° C durante al menos 3 meses (asegúrese de que para disolver completamente precipitado similar a un gel antes de cada uso) 3.
- Tome una manga de 60 mm x 15 mm de poliestireno placas de Petri y diseñar ambas tapas y fondos en el banc....
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Resultados
GFP y mCherry construcciones informadoras fueron transcrito in vitro y microinyectado en los huevos recién fertilizados. Los embriones se incuban a 15 ° C durante 24 horas (hasta la etapa de blástula), y utilizando imágenes Zeiss Observador Z1 microscopio. La inyección de construcciones reportero no condujo a ningún defectos de desarrollo (Figura 6). Para la cuantificación de las señales fluorescentes, adquisición de imágenes se realizó a baja magnificación (100X) para capturar al máximo píxele.......
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Discusión
La microinyección es una técnica poderosa para la entrega de diversos tratamientos, tales como ADN, ARNm, proteínas recombinantes, pérdida de la función y la ganancia de función de reactivos, colorantes y sus combinaciones en huevos, embriones y células de diversos organismos 1-7. Sin embargo, varias consideraciones deben ser tenidas en cuenta al diseñar un experimento de microinyección.
Es sumamente importante tener en cuenta la solubilidad del tratamiento administrado y el volum.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Santiago Suarez para la lectura crítica del manuscrito y Betty Cowgill para la ayuda en la fotografía. También agradecemos a los revisores anónimos por sus comentarios críticos. Este trabajo es apoyado por la Universidad de Delaware Fondo de Investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipetas de vidrio Pasteur VWR | 14673-043 | ||
| Microscopio invertido Axiovert 40 ° C | Zeiss | 4109431007990000 | Microscopio de inyección |
| Puntas de microcargador | Eppendorf | 5242 956.003 | Solución de inyección de |
| carga Malla filtrante de nailon 80 μ m | Amazon.com | 03-80-37 | Filtre los huevos para eliminar los residuos |
| P20 o P200 Boquillas de pipeta de barrera contra aerosoles | Fisher Scientific | 02707432 o 02707430 | Parte de una pipeta bucal |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Parte de una pipeta bucal |
| Tubo de polietileno | Intramedic | PE-160 | Parte de una pipeta bucal |
| Sulfato de protamina | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Adjuntar huevos dejellidos a las placas |
| de inyección Erizos de mar S. purpuratus | Pt. Laboratorio de Invertebrados Marinos de Loma | N/A | |
| Agua de mar | cualquier tienda de mascotas | Instant Ocean | |
| Placa de Petri de poliestireno estéril de 60 mm x 15 mm Fisher | Scientific | 0875713A | Placas |
| de inyección Micromanipulador de posicionamiento grueso de tres ejes MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipular aguja |
| de inyección Tipo joystick de tres ejes Aceite Hidráulico Micromanipulador fino MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipular aguja de inyección |
| Pipetas de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical tirador de agujas | Narishige | PC-10 | Agujas de inyección |
Referencias
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y.
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Reimpresiones y permisos
