Visualización del flujo citoplasmático durante la cicatrización de heridas unicelulares en Stentor coeruleus

Resumen

El ciliado gigante Stentor coeruleus es un sistema clásico para estudiar la regeneración y la cicatrización de heridas en células individuales. Al obtener imágenes de las células de Stentor simultáneamente con aumento bajo y alto, es posible medir los flujos citoplasmáticos antes, durante y después de la herida.

Resumen

Aunque la cicatrización de heridas a menudo se aborda a nivel de tejidos completos, en muchos casos las células individuales son capaces de curar heridas dentro de sí mismas, reparando la membrana celular rota antes de que el contenido celular se escape. El organismo unicelular gigante Stentor coeruleus, en el que las células pueden tener más de un milímetro de tamaño, ha sido un organismo modelo clásico para estudiar la cicatrización de heridas en células individuales. Las células de stentor se pueden cortar por la mitad sin pérdida de viabilidad, e incluso se pueden cortar e injertar juntas. Pero esta alta tolerancia al corte plantea la pregunta de por qué el citoplasma no fluye simplemente a partir del tamaño del corte. Aquí presentamos un método para cortar células de Stentor mientras simultáneamente se obtienen imágenes del movimiento del citoplasma en las proximidades del corte a alta resolución espacial y temporal. La clave de nuestro método es utilizar una configuración de microscopio de "doble piso" en la que la cirugía se realiza bajo un microscopio de disección enfocado en una cámara que se ve simultáneamente desde abajo a alta resolución utilizando un microscopio invertido con una lente de alta NA. Esta configuración permite un alto nivel de control sobre el procedimiento quirúrgico y, al mismo tiempo, permite un seguimiento de alta resolución del citoplasma.

Introducción

La regeneración y la cicatrización de heridas son procesos biológicos importantes cuyos mecanismos siguen siendo áreas de investigación activa. De hecho, la capacidad de curar heridas y regenerar partes dañadas es una de las características que diferencia a los seres vivos de los objetos inanimados. Normalmente, se cree que la regeneración está mediada por la diferenciación de las células madre en varios tipos de células necesarias para reconstruir una parte de un animal dañada o cortada, mientras que la cicatrización de heridas se ve en términos de nuevas células que invaden una herida para reconstruir un epitelio intacto. Por lo tanto, ambos procesos parecen estar mediados por colectivos de células individuales y, por lo tanto, parecen ser procesos multicelulares por excelencia. Por lo tanto, es potencialmente sorprendente que las células individuales sean, en algunos casos, capaces de reparar heridas y regenerar componentes perdidos¹. La cicatrización de heridas dentro de células individuales puede implicar múltiples vías, incluida la contracción de la cadena de bolsa de actina-miosina alrededor de la herida y el parche de la membrana mediante la fusión rápida de vesículas exocíticas^1-3. Aunque muchos tipos de células son capaces de algún grado de cicatrización de heridas^4-6, quizás el ejemplo más dramático es el ciliado gigante Stentor coeruelus⁷, que se muestra en la Figura 1. Las células individuales de Stentor miden 1 mm de largo y están cubiertas con filas de cilios. Las células de los stentores tienen forma de cono con un aparato oral, que consta de miles de cilios, en un extremo, y una estructura estrecha en el otro extremo. Stentor era un organismo modelo clásico para estudiar la regeneración, ya que si se cortaba alguna parte de la célula, podía^regenerarse. Por ejemplo, en una serie clásica de experimentos, Thomas Hunt Morgan⁸ demostró que una célula de Stentor podía cortarse por la mitad y cada mitad regeneraría una célula de proporciones normales en cuestión de horas⁸. Las vías moleculares responsables de la regeneración en Stentor siguen siendo completamente desconocidas.

La capacidad de las células de Stentor para servir como un sistema modelo de regeneración depende de la asombrosa capacidad de estas células para curarse a sí mismas después de ser cortadas. ¿Por qué el citoplasma de una célula de Stentor no se filtra cuando se corta la célula? La cicatrización de heridas no se debe a la contracción inmediata de la corteza celular, ya que es posible tomar dos células de Stenttor, cortarlas y luego unir las dos células cortadas en varias configuraciones⁷. Durante tales experimentos de injerto, el citoplasma de las dos células debe permanecer expuesto, ya que se fusiona cuando las células se juntan. De alguna manera, el citoplasma está lo suficientemente expuesto al medio circundante para permitir el injerto, pero aún así no fluye fuera de la célula. ¿Es el citoplasma de Stentor lo suficientemente elástico como para que simplemente no pueda fluir incluso cuando se hace un gran agujero en la membrana plasmática? ¿Las células aumentan la viscosidad del citoplasma localmente alrededor de una herida para evitar que el citoplasma fluya? El citoplasma es un material activo^{altamente complejo 9-11}, y la respuesta de cicatrización de heridas de Stentor representa una oportunidad única para estudiar los flujos citoplasmáticos y la mecánica durante la cicatrización de heridas unicelulares. Sin embargo, el uso de métodos quirúrgicos para inducir heridas en Stentor plantea un desafío técnico. Para cortar una célula de 1 mm de largo utilizando agujas de vidrio, el paradigma quirúrgico convencional, es necesario operar a bajo aumento con una larga distancia de trabajo. En estas condiciones de imagen, no es posible rastrear el flujo de citoplasma, y todo lo que se puede determinar es si el citoplasma permanece dentro de la célula o no. La verdadera pregunta que nos gustaría hacer es cómo puede cambiar el movimiento y la viscosidad del citoplasma durante el corte y la curación. Esto requiere imágenes de alta resolución. En este trabajo presentamos una adaptación del protocolo de Tártaro para el corte de Stentor⁷ que permite realizar el corte con óptica de menor aumento para ver toda la célula y, al mismo tiempo, observar el flujo del citoplasma a alta resolución, lo que permite utilizar este sistema como plataforma para explorar los mecanismos de cicatrización de heridas unicelulares.

Protocolo

1. Cultivo y recolección celular

1. Obtenga células de Stentor coeruleus de estanques naturales como se describe en Tartar⁷ o de un proveedor comercial (ver Reactivos).
2. Mantener los cultivos cultivando en la oscuridad a 20 ºC en Medio Stentor Modificado (MSM), que se adapta de las recetas descritas por Tartar⁷ y De Terra¹² que contienen 0,75 mM Na₂CO₃, 0,15 mM KHCO₃, 0,15 mM NaNO₃, 0,15 mM KH₂PO₄, 0,15 mM MgSO₄, 0,5 mM CaCl₂, y 1,47 mM de NaCl.
3. Complemente el medio MSM con una fuente de carbono agregando presas vivas al medio. Cultive cultivos de Chlamydomonas reinhardtii en medio TAP utilizando métodos de cultivo estándar¹³. Antes de alimentar, lave las células de Chlamydomonas en MSM. Alimente 300 ml de cultivos de Stentor ~ 3 x 10⁷ células de Chlamydomonas 2-3 veces por semana.
4. Recoja las células de Stentor para la cirugía con una pipeta. Los stentor tienden a anclarse al fondo y a los lados de la placa de cultivo y, por lo tanto, para recolectar células, agite el cultivo haciendo burbujear aire a través de la punta de una pipeta hasta que las células comiencen a desprenderse y nadar libremente.
5. Capture las células natatorias con una pipeta equipada con una punta de diámetro ancho para evitar el cizallamiento de las células.
6. Lave las células recolectadas en MSM fresco.

2. Preparación de herramientas para microcirugía

1. Sostenga dos varillas de vidrio para remover sobre un mechero Bunsen u otra llama hasta que los extremos comiencen a derretirse.
2. Toca los extremos de las dos varillas para que el vidrio fundido se fusione.
3. Después de crear una pequeña gota de vidrio fundido entre las dos varillas, retírelas de la llama, déjelas enfriar durante 1-2 segundos y luego sepárelas para hacer una ruptura limpia. Idealmente, el vidrio se sacará en tiras delgadas y se romperá suavemente a medida que el vidrio se enfría, lo que dará como resultado una aguja de aproximadamente 1-2 cm de largo con punta fina en el extremo (Figura 2).
4. Si la aguja resultante no es óptima, las puntas pueden romperse en residuos de vidrio y las varillas pueden reutilizarse.

3. Montaje de células para microcirugía y observación (cirugía normal)

1. Prepare una cámara cuadrada con paredes de vaselina utilizando un sello de goma cuadrado recubierto de vaselina y presionado sobre un cubreobjetos de vidrio.
2. Agregue MSM que contiene un 2% de metilcelulosa al cuadrado de vaselina.
3. Coloque el cubreobjetos en un adaptador de plástico, lo que permite colocarlo en un microscopio con un portaobjetos estándar (Figura 3).
4. Agregue las células lavadas del paso 1.6 al MSM más metilcelulosa para impedir la motilidad de las células Stentor para que permanezcan en su lugar durante la cirugía.
5. Organice las células de la metilcelulosa de manera que estén espaciadas uniformemente y se empujen lo suficientemente cerca de la superficie del cubreobjetos para estar enfocadas durante la toma de imágenes.

4. Imágenes de alta resolución de la cicatrización de heridas en stentor vivo

Para obtener simultáneamente imágenes de una célula Stentor a alta resolución mientras la corta quirúrgicamente con bajo aumento, construya un microscopio de "doble piso" con un telescopio de disección conectado a la cabeza del ocular del visor invertido de modo que se enfoque en la parte superior del portaobjetos mientras que el endoscopio invertido se enfoca desde debajo del portaobjetos.

1. Coloque una corredera en el visor invertido (utilice una Zeiss Axiovert 200M o una Olympus IX80).
2. Retire el cuerpo del microscopio de disección de su soporte y determine la posición aproximada sobre el ocular del microscopio invertido para colocar el osciloscopio de disección para permitir que el portaobjetos se visualice con un aumento bajo.
3. Modifique una caja de cartón para que tenga el mismo grosor que el espacio deseado entre la cabeza del ocular del visor invertido y el visor de disección, luego péguelo con cinta de laboratorio que se puede quitar fácilmente cuando se complete el experimento. Ajuste el grosor de la caja de acuerdo con la configuración exacta de la cabeza del ocular del microscopio invertido y con el tamaño del microscopio de disección para que la muestra esté en el campo de visión sin necesidad de mover el visor de disección después de colocarlo.
4. Sosteniendo el telescopio de disección contra la caja, muévalo hasta que el portaobjetos esté enfocado, luego vuelva a pegarlo a la caja con cinta de laboratorio. La configuración final se muestra en la Figura 4.
5. Visualice las células a través de un visor invertido utilizando óptica DIC y una lente de objetivo aéreo de 20X. Utilice un condensador DIC de larga distancia de trabajo para proporcionar suficiente espacio para realizar la microcirugía desde arriba.
6. Adquiera imágenes a una velocidad de fotogramas de 2 imágenes/s con una cámara CCD de 512 x 512.
7. Comience la adquisición antes de comenzar a cortar las células para capturar el patrón de flujo citoplasmático inicial y observar todas las etapas del proceso de herida y cicatrización de heridas.
8. Finalizar la adquisición cuando la célula ha retomado su apariencia normal y/o motilidad activa, con el fin de visualizar y medir los movimientos citoplasmáticos a lo largo del proceso de regeneración.

5. Análisis del flujo citoplasmático durante la cicatrización de heridas

Mida el flujo citoplasmático utilizando la velocimetría de imágenes de partículas (PIV). Esta técnica es rutinaria en el estudio de la dinámica de fluidos, y puede generar campos de flujo en ausencia de partículas rastreables individualmente en el fluido. La PIV se ha utilizado para medir los flujos de citoplasma basándose en imágenes de vesículas subcelulares y otras características visibles en el citoplasma mediante microscopía de luz transmitida¹⁴.

1. Descargue PIVLab, un paquete de MATLAB para PIV, desde el sitio web http://pivlab.blogspot.com/.
2. Cargue la pila de imágenes tiff para cada secuencia de vídeo en el programa PIV de MATLAB.
3. Genere manualmente una máscara para cada pila de imágenes para enmascarar regiones de los datos sin procesar fuera del cuerpo de Stentor.
4. Configure PIVLab para usar la configuración de transformación rápida de Fourier y un tamaño de bin de 64 x 64 píxeles, que agrupará los píxeles de cada fotograma en píxeles cuadrados más grandes.
5. Ejecute PIVLab para calcular las correlaciones cruzadas entre los píxeles de cada fotograma con los píxeles cercanos del siguiente fotograma para producir un vector de flujo dependiente del tiempo centrado en cada píxel agrupado, que tiene la misma resolución de tiempo que nuestros datos sin procesar.
6. Calcule los promedios de tiempo de la salida del campo vectorial resultante para generar líneas de corriente para la comparación entre los datos tomados con el Stentor antes del corte y durante la cicatrización de heridas, y calcule histogramas de velocidades de flujo (para estudiar la intensidad del flujo) y el cambio de velocidad en un píxel determinado a lo largo del tiempo (para estudiar las fluctuaciones de flujo).
7. Para secuencias de imágenes con Stentor dividido por la mitad y citoplasma filtrándose visiblemente en el tampón circundante, calcule el flujo total de citoplasma de regreso al cuerpo celular propiamente dicho multiplicando la velocidad de flujo promedio por el área de la sección transversal de la base de la burbuja extracelular de citoplasma.

Resultados

Utilizando los protocolos descritos anteriormente, se encontró que el citoplasma de Stentor es notablemente dinámico, tanto antes como después del corte. El video 1 muestra el extenso flujo de citoplasma presente en las células sin cortar. A pesar de nuestra expectativa original de que la capacidad de Stentor para sobrevivir al corte implicaría un endurecimiento o gelificación del citoplasma, de hecho, cuando las células de Stentor se cortan con suficiente violencia para extraer el citoplasma de la célula, el citoplasma permanece altamente dinámico y logra fluir de regreso a la célula de una manera altamente dirigida (Video 2).

Además de demostrar un grado previamente insospechado de movimiento citoplasmático durante la cicatrización de heridas, la alta resolución de las imágenes en el ensayo se puede utilizar para cuantificar los caudales utilizando la velocimetría de imágenes de partículas. La capacidad de realizar tales mediciones permitirá probar rigurosamente el efecto de los inhibidores químicos.

Figura 1. Morfología de una célula viva de Stenttor. Imagen de campo oscuro de una célula viva de Stentor que ha sido alimentada con Chlamydomonas como se describe en el Procedimiento 1.3, visible como material verde dentro de vacuolas de alimentos. El aparato oral a través del cual la célula come es visible como un borde de cilios en la parte superior de la imagen. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Preparación de la aguja de vidrio para la cirugía. (A) La aguja se extrae del extremo de una varilla de vidrio sólido. (B) Vista de alto aumento de la punta de la aguja que indica la longitud y el filo necesarios para la cirugía. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Portacubreobjetos personalizado para microcirugía. Con el fin de permitir el acceso abierto para la cirugía y al mismo tiempo permitir condiciones óptimas para la obtención de imágenes, las células se montan en un cubreobjetos en lugar de un portaobjetos grueso. Con el fin de permitir que el cubreobjetos quepa en la platina del microscopio, se puede fabricar un soporte de plástico utilizando una impresora 3D. El soporte tiene las mismas dimensiones que un portaobjetos de microscopio estándar, mientras que la depresión en el centro coincide con las dimensiones del cubreobjetos. Un orificio en una esquina permite que el cubreobjetos se saque del soporte. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Configuración de microscopio de dos pisos. Un cabezal de microscopio de disección está montado en la parte superior del cabezal del ocular de un microscopio invertido. La cinta de laboratorio permite que el aparato se ensamble y desmonte rápidamente cuando se completa el experimento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Video 1. Ejemplo de flujo citoplasmático observado en una célula Stentor viva. Imagen de celda con objetivo 10X con óptica de campo oscuro a una velocidad de 2 fotogramas/seg.

Video 2. Imagen de una célula Stentor mientras se corta y se rompe con una aguja de vidrio. Después de cortar, se ha extraído una cantidad sustancial de citoplasma del cuerpo celular principal, pero fluye rápidamente de regreso a la célula.

Discusión

La aplicación más importante de este método será utilizarlo para determinar las vías moleculares que regulan el flujo citoplasmático durante la cicatrización de heridas en Stentor. Existe una amplia gama de inhibidores químicos que se dirigen a las proteínas motoras, así como a los componentes del citoesqueleto. Los inhibidores de la señalización del calcio también serían candidatos probables. También sería interesante eliminar o reducir los gránulos de pigmento (extruomas) que contienen el pigmento azul Stentorin, cuya liberación de la célula se desencadena bajo estrés, y preguntarse cómo la liberación exocitótica de Stentorin puede afectar el flujo del citoplasma cercano. El pigmento se puede agotar con un simple tratamiento de blanqueo¹⁵ que se puede hacer justo antes del corte. No parece haber una forma sencilla de realizar el ensayo de cicatrización de heridas de forma paralela, ya que las células deben cortarse y visualizarse una a la vez. Por lo tanto, utilizando un solo microscopio, sería posible operar y medir células a una velocidad de aproximadamente 1 cada 0,5 horas, de modo que durante un solo día de trabajo debería ser posible obtener suficientes puntos de datos para que un solo compuesto determine si tiene un efecto estadísticamente significativo en el proceso. Si bien el método no es en ningún sentido de alto rendimiento, será absolutamente factible examinar a través de un conjunto seleccionado de compuestos candidatos específicos para unas pocas vías objetivo cuidadosamente elegidas.

Una limitación importante del enfoque actual es el método relativamente rudimentario para ensamblar el microscopio de dos pisos. Suponiendo que el microscopio invertido utilizado para obtener imágenes es un instrumento de uso general que otros trabajadores necesitan usar para otros fines, una consideración importante es la facilidad con la que se puede desmontar y volver a montar el aparato. Si bien el método actual que utiliza cinta de laboratorio es realmente rápido y fácil de desmontar, requiere una alineación cuidadosa por parte del usuario durante el ensamblaje cada vez. Por lo tanto, una modificación importante sería construir un soporte extraíble personalizado con ranuras para la cabeza del ocular del endoscopio invertido y el cuerpo del endoscopio de disección. Esto debería ser fácil de fabricar utilizando la tecnología moderna de impresoras 3D.

Una segunda limitación del enfoque es la dependencia de las imágenes DIC de orgánulos intracelulares como marcadores de flujo. Debido a que actualmente no se conoce la identidad de estos orgánulos observados en el microscopio, no es posible conocer su tamaño o posibles interacciones con otros componentes celulares. Por lo tanto, podría ser ventajoso inyectar trazadores extrínsecos como perlas fluorescentes y usarlos para rastrear el flujo. Sin embargo, esto requeriría un paso adicional, la microinyección, antes de que se pudiera realizar el experimento, lo que ralentizaría aún más el ensayo.

La última limitación clave es la dependencia de un solo plano de imagen para la adquisición de datos. La importancia primordial de este ensayo es que va más allá de simplemente preguntar si una herida cicatriza o no, y permite obtener un análisis detallado del patrón de flujo. En este sentido, será extremadamente importante extender las imágenes a imágenes tridimensionales. El método actual toma imágenes de un solo plano focal y, por lo tanto, cuando se realiza el análisis PIV, el resultado es un corte a través del campo de flujo tridimensional completo. Esto es informativo pero incompleto. Al adquirir imágenes 3D en cada paso de tiempo, debería ser posible obtener un campo de flujo completamente tridimensional. Esto será particularmente crítico para observar exactamente cómo se mueve el citoplasma en las inmediaciones del sitio de la herida.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Stentor coeruleus cultivo vivo	Carolina Biological 131598
Metilcelulosa, 1.500 cP	Sigma	M0387
EQUIPO: Material
Nombre	catálogo		la empresa
Varilla agitadora de vidrio blando 5 pulgadas de largo	Fisher Scientific	11-380A
Plato de cultivo 4.5 en 250 ml  vidrio	Carolina Biological 741004
IX81 microscopio invertido	Olympus
Axiovert 200M microscopio invertido	Zeiss
Stemi 2000 Microscopio estereoscópico	Zeiss
Evolve 512 x 512 Cámara EMCCD	Fotometría
Plan Apo 20X objetivo	Olympus	UPLSAPO