Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Resumen

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Resumen

Las proteínas llevan a cabo tareas cruciales en los organismos al ejercer funciones derivadas de sus pliegues tridimensionales específicos. Aunque las estructuras nativas de los polipéptidos cumplen muchos propósitos, ahora se reconoce que la mayoría de las proteínas pueden adoptar un ensamblaje alternativo de amiloide rico en láminas beta. Las fibrillas insolubles de amiloide se asocian inicialmente con múltiples dolencias humanas, pero cada vez se muestran más como actores funcionales que participan en varios procesos celulares importantes. Además, el amiloide depositado en los tejidos del paciente contiene componentes no proteicos, como ácidos nucleicos y glicosaminoglicanos (GAG). Estos cofactores pueden facilitar la formación de amiloide, lo que resulta en la generación de diferentes tipos de precipitados insolubles. Aprovechando nuestra comprensión de cómo las proteínas se pliegan mal a través de una etapa intermedia del precursor de amiloide soluble, hemos ideado un método para convertir las proteínas nativas en fibrillas de amiloide in vitro. Este enfoque permite preparar amiloide en grandes cantidades, examinar las propiedades del amiloide generado a partir de proteínas específicas y evaluar los cambios estructurales que acompañan a la conversión.

Introducción

Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes presentes en todo tipo de células. Se presentan en una gran variedad de tamaños, estructuras y modificaciones postraduccionales, y cumplen una enorme gama de funciones biológicas importantes cuando se encuentran en sus formas nativas. Más de dos docenas de polipéptidos aberrantes han sido implicados en numerosas condiciones patológicas humanas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes tipo^{2 1-4}. Las proteínas terminales mal plegadas se acumulan como fibrillas de amiloide, los agregados estables insolubles que se producen extracelular o intracelularmente.

Protocolo

1. Preparar el búfer MES

1. Utilice tampón MES (ácido 0,1 M, 2-(N-morfolino)etanosulfónico y NaCl 0,9 M) para preparar amiloide solo proteína, así como oligómeros de proteínas solubles estabilizadas. Pesa 1,95 g de MES y 5,27 g de NaCl. Agregue H₂O y ajuste el pH a 4.7. Completar el volumen final hasta 100 ml. Almacenar a 4º C hasta por 6 meses.

2. Prepare amiloide solo para proteínas directamente a partir de proteínas nativas

1. Pesar la proteína de elección (cualquier proteína o péptido nativo) y reconstituir a 10 mg/ml en tampón MES.
2. Incubar a 65 ºC en baño maría durante 4 h. Al final del per....

Resultados

La capacidad de convertir proteínas nativas directamente en amiloide depende del cambio conformacional que ocurre a alta temperatura en el tampón MES. La precipitación en la solución es una buena indicación de agregación proteica y posiblemente de formación de amiloide. Por otro lado, para permitir que el oligómero proteico soluble se estabilice, se utiliza EDC para entrecruzar las proteínas y solidificar la conformación oligomérica inducida en el tampón MES. Como resultado, los oligómeros proteicos estabilizados son pro.......

Discusión

El método descrito aquí ofrece un medio rápido y flexible para preparar fibrillas amiloides in vitro a partir de prácticamente cualquier proteína o péptido de elección. Se pueden preparar de manera confiable varios tipos diferentes de amiloide: fibrillas solo de proteínas o agregados híbridos que contienen ADN, ARN o glicosaminoglicanos. Los procedimientos involucrados son simples, directos y no requieren capacitación técnica avanzada. El amiloide preparado por este método es bastante estable y puede almacenarse.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M8250
NaCl	Fisher	BP358-10
Clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil] (EDC)	Thermo/Pierce	22980
ADN de esperma de salmón	Sigma	D1626
ARN de levadura torula	Sigma	R6625
Heparina de la mucosa intestinal porcina	Sigma	H3149
Tris base	Fisher	BP152-1
Equipo:
Baño de agua	Fisher Science	Isotemp 210
Slide-A-Lyzer casete de diálisis	Thermo/Pierce	66380