El cortisol (CORT) se acumula en el eje del pelo cada vez mayor de los seres humanos y los primates no humanos. Se describen métodos para la extracción y el análisis de CORT cabello con alta precisión y sensibilidad. Medición de pelo CORT está particularmente bien adaptado para la evaluación de estrés crónico durante períodos de semanas a meses.
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Artículo de método
Extracción y análisis de cortisol de Derechos Humanos y de mono de pelo
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Resumen
Resumen
La hormona del estrés cortisol (CORT) se incorpora lentamente en el eje del pelo que crece de los seres humanos, primates no humanos, y otros mamíferos. Hemos desarrollado y validado un método para la extracción y el análisis de CORT pelo de mono rhesus y posteriormente adaptado este método para su uso con el pelo del cuero cabelludo humano. En contraste con CORT "muestras puntuales" obtenidos a partir de plasma o saliva, pelo CORT proporciona una medida integrada de la actividad del sistema hipotálamo-pituitaria-adrenocortical (HPA), y por lo tanto el estrés fisiológico, durante el período de incorporación de la hormona. Dado que el cabello del cuero cabelludo humano crece a una tasa promedio de 1 cm / mes, los niveles de CORT obtenidos a partir de segmentos de cabello varias cm de longitud potencialmente pueden servir como un biomarcador de estrés experimentado durante varios meses.
En nuestro método, cada muestra de cabello se lava primero dos veces en isopropanol para eliminar cualquier Cort de la parte exterior del eje del pelo que se ha depositado por el sudor o el sebo. Después del secado, lala muestra se muele a un polvo fino para romper la matriz de proteína del cabello y aumentar el área de superficie para la extracción. CORT desde el interior del eje del pelo se extrajo en metanol, el metanol se evaporó, y el extracto se reconstituyó en tampón de ensayo. Extraídas Cort, junto con los estándares y controles de calidad, se analiza a continuación, por medio de un inmunoensayo enzimático disponible comercialmente sensible y específica (EIA) del kit. Lectura de la EIA se convierte a CORT pg por mg de peso de pelo en polvo. Este método se ha utilizado en nuestro laboratorio para analizar CORT cabello en los seres humanos, varias especies de monos macacos, monos tití, perros y osos polares. Muchos estudios, tanto de nuestro laboratorio y de otros grupos de investigación han demostrado la amplia aplicabilidad de CORT pelo para evaluar la exposición al estrés crónico en natural, así como la configuración de laboratorio.
Introducción
Medición de CORT en el plasma, la saliva, o de vez en cuando en la orina o las heces se ha utilizado como un índice de estrés fisiológico desde el descubrimiento de Selye de la función del eje HPA en el estrés 1. Aunque numerosos trabajos se han publicado en relación actividad HPA a situaciones de estrés agudo, el campo se ha visto obstaculizado por la falta de un índice simple y fiable de estrés fisiológico crónica. Este problema surge porque el plasma y saliva tanto rendimiento estima "punto" de la actividad HPA que están sujetos a variación circadiana y puede ser confundida por las perturbaciones ambientales. Muestras urinarias y fecales producen mediciones de CORT y / o eliminación de los metabolitos que abarcan un número de horas hasta un día completo en algunos casos. Colección de muestras múltiples utilizando cualquiera de estas matrices puede proporcionar un índice compuesto en bruto de los niveles de CORT lo largo del tiempo, sin embargo, ninguno de estos enfoques proporciona un índice verdaderamente a largo plazo de la actividad HPA y la capacidad de respuesta de este SYdetener a los factores estresantes crónicos.
Medición de CORT en el cabello ha comenzado a llenar esta importante necesidad en la literatura estrés. Los estudios iniciales realizados por varios laboratorios demostraron la presencia de CORT en el cabello humano, pero no investigaron si los niveles de CORT pelo cambian en función de la tensión 2. A medida que nuestro laboratorio ha estado interesado desde hace muchos años en la regulación del eje HPA mono rhesus por diversos factores sociales y de comportamiento 3, nos propusimos establecer y validar métodos para la extracción y el análisis de pelo de mono rhesus 4. Basado en la premisa de que CORT transmisión sanguínea se incorpora lentamente y de forma continua en el crecimiento del cabello, el propósito de este nuevo método era utilizar niveles de CORT derivado del pelo como un índice integrado de la actividad HPA durante períodos de semanas o meses.
Se han encontrado varios problemas metodológicos en la elaboración del presente protocolo. En primer lugar, los estudios anteriores habían demostrado que pequeñas cantidades of circulantes CORT se excretan en el sudor y el sebo, por lo que podría cubrir el exterior del eje del pelo 2. A fin de eliminar este potencial factor de confusión, hemos desarrollado un procedimiento de lavado suave que aparece para eliminar CORT externo mientras que tiene un efecto mínimo en CORT presente dentro del eje del pelo que crece. Por lo tanto, el pelo mono sometido a este procedimiento (es decir, de dos lavados de 3 minutos con isopropanol) perdió aproximadamente 7-8% del contenido total de CORT pelo, y un tercio de lavado elimina menos de 1% más esteroides de la muestra 4. No parece haber más CORT externa en el cabello humano, ya que el mismo procedimiento elimina un promedio de 27% de contenido total de Cort de las muestras (K. Rosenberg y J. Meyer, no publicado). Al igual que el pelo de mono, sin embargo, un lavado adicional contenía mucho menos CORT (alrededor del 7%) que los dos primeros lavados. Por lo tanto, los resultados de ambos mono y el cabello humano apoyan el argumento de que la mayoría (si no todos) CORT externa se puede quitar mientras se mantiene una fracción importanteción de CORT dentro de la matriz del pelo interno. En segundo lugar, nuestros estudios piloto mostraron también que la molienda del pelo antes de la extracción aumentado significativamente la recuperación Cort de la muestra, presumiblemente mediante la ruptura abierta la compleja matriz proteínica del eje del pelo, así como aumentar el área de superficie disponible para la penetración de disolvente. Dos métodos de molienda se desarrollaron diferentes, cada uno con ventajas y desventajas. Método 1, que utiliza un molino de bolas, tiene la ventaja de producir el polvo más fino. Sin embargo, un molino de bolas es un elemento de un equipo relativamente caro y, si se usa con recipientes de molienda y bolas estándar, que es capaz de moler sólo dos muestras a la vez. Las muestras pequeñas también son difíciles de procesar usando un molino de bolas con recipientes de molienda estándar. Método 2, que utiliza un BeadBeater, es menos eficaz en su capacidad de molienda. Como resultado, la recuperación media CORT es de aproximadamente 10% inferior utilizando este método en comparación con el molino de bolas (datos no publicados). Por otro lado, un BeadBeateres considerablemente menos caro que un molino de bolas, 16-24 muestras se pueden moler a la vez, dependiendo del modelo, y el método es muy adecuado para muestras pequeñas. Debido a la recuperación diferencial mencionado anteriormente, es aconsejable utilizar el mismo método de molienda para todas las muestras dentro de un estudio particular.
Una vez que se han procesado las muestras de cabello, que se extraen con metanol y CORT en los extractos se analizaron por medio de un kit de EIA comercial sensible y específica originalmente diseñado para medir CORT salival. Los procedimientos de extracción y ensayo fueron validados en parte mediante la demostración de que las diluciones seriadas de los extractos de las muestras de pelo de mono produjeron lecturas paralelas a EIA de cerca las lecturas obtenidas de los estándares CORT auténticos. A continuación, mostramos que CORT pelo (además de plasma y CORT salival) fue sensible a la importante factor estresante vida de una reubicación administrativamente mandato de los monos a los nuevos cuartos de vivienda 4,5. La present documento ofrece una descripción detallada de los métodos que se utilizan de forma rutinaria en nuestro laboratorio para procesar las muestras de cabello humano y del mono y extraer y analizar CORT de tales muestras.
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Protocolo
1. Recogida y almacenamiento
- Pelo humano
- Asegure toda la longitud del cabello a ser muestreada (hasta un lápiz de ancho de diámetro) con una banda de goma o clip. Cortar el pelo tan cerca del cuero cabelludo como sea posible (teniendo cuidado de no cortar la piel) con unas tijeras limpias. Nota: El área de muestreo estándar es el vértice posterior del cráneo.
- Algunos investigadores han informado de una disminución en los niveles de CORT cabello humanos con la distancia desde el cuero cabelludo 6, que puede ser debido al lavado de la exposición repetida al agua y champú 7 (aunque ver Manenschijn et al. 8 y Thomson et al. 9 para resultados contrarios en que no se observó disminución segmentaria) Para minimizar el impacto de este potencial "efecto de lavado", se recomienda la recolección de los segmentos proximal del pelo en el cuero cabelludo con una longitud no superior a 3 cm (suponiendo una tasa de crecimiento promedio de 1 cm / mes 10, un 3 cm segmento contiene CTRO que se ha depositado sobre aproximadamente los últimos 3 meses). Para lograr esto, utilice una regla para medir 3 cm desde el primer corte y cortar de nuevo para producir la muestra de 3 cm. Nota: Una vez que el pelo ha sido cortado a la medida, ya no es necesario mantener las hebras en alineación a menos que el estudio consiste en cortar la muestra en segmentos de 1 cm de largo por separado para establecer un calendario retrospectivo de CORT deposición sobre el período de tiempo antes de la toma de muestras 6.
- Coloque la muestra de pelo en una bolsa hecha de papel de aluminio, un sobre de papel limpia, o un tapón de rosca de polipropileno tubo de centrífuga de 15 ml del tipo utilizado para el lavado de la muestra. Como CORT es extremadamente estable en el pelo 2, las muestras pueden ser almacenadas indefinidamente a -20 ° C y, si es necesario, enviado durante la noche a temperatura ambiente.
- El procedimiento de recogida de pelo debe ser practicado en los voluntarios y las muestras de la práctica se debe pesar antes de emprender un estudio completo. Nota: Las muestras de pelo como smaLL como 5-10 mg se pueden analizar usando los métodos descritos aquí, aunque es deseable para recoger muestras> 10 mg para minimizar la probabilidad de obtener lecturas de EIA por debajo de la norma CORT más bajo.
- Pelo del mono
- Afeitarse el pelo (100-250 mg) de la nuca del cuello con un clipper animal estándar. Afeitarse tan cerca de la piel como sea posible, teniendo cuidado de no cortar la piel y causar sangrado porque los niveles de CORT en la sangre son muy altos en comparación con los que se encuentran en el cabello. Nota: La zona del cuello fue elegido para el muestreo de rutina debido a que es generalmente una buena fuente de cabello y se puede observar fácilmente para la regeneración del cabello antes de remuestreo.
- Coloque la muestra de pelo en una bolsa hecha de papel de aluminio o un tapón de rosca de polipropileno tubo de centrífuga de 15 ml. Muestras de cabello mono deben ser almacenados y enviados en la misma manera que la descrita anteriormente para las muestras de cabello humanos.
- Dado que el cabello mono, a diferencia de pelo del cuero cabelludo humano, crece hasta una longitud determinada y luego stops crecimiento 11, generalmente no es factible en este caso utilizar distancia de la piel como un calendario para CORT deposición. Sin embargo, si un animal puede ser muestreado más de una vez (por ejemplo, durante los exámenes rutinarios de salud periódicos), es deseable llevar a cabo una de afeitar inicial para establecer un punto de tiempo de la línea de base y después reshave la misma zona después de que haya transcurrido el período de tiempo deseado. CORT en la segunda muestra se deposita durante el intervalo del afeitado reshave, que permite una precisa atribución de contenido CORT de la muestra a la actividad HPA durante ese intervalo de 5.
2. Lavado y secado de la muestra
- Lavado
- Colocar cada muestra de pelo en un tapón de rosca de polipropileno tubo de centrífuga de 15 ml.
- Añadir 5 ml de cromatografía líquida de alto rendimiento de isopropanol (HPLC) de grado a cada tubo seguido por inversión repetida durante 3 min usando un rotador.
- Decantar el isopropanol en un contenedor de residuos, teniendo cson de no perder ninguna de la muestra.
- Repita los pasos 2.1.2 y 2.1.3, una vez más.
- El secado
- Secar el cabello durante al menos 2-3 días para asegurar la evaporación completa isopropanol.
3. Molienda de muestras y extracción CORT - Método 1 para muestras grandes
- Molienda de la muestra
- Coloque un máximo de 250 mg de cabello secado en un 10 ml de acero inoxidable rectificado jar junto con una sola bola de molienda de acero inoxidable de 12 mm.
- Triturar la muestra durante 6 min a una velocidad de 25 Hz utilizando un molino de bolas.
- Pesar hasta 50 mg de pelo empolvado en una balanza analítica y luego transferirlo a un tubo de microcentrífuga limpio de 2,0 ml de polipropileno para la extracción CORT posterior.
- Extracción de CORT
- Añadir 1,0 ml de metanol de grado HPLC al tubo de microcentrífuga que contiene la muestra en polvo.
- Tapar el tubo e incubar la muestra durante 18-24 horas a temperatura ambiente con el coinversión nStant usando un rotador.
- Centrifugar los tubos a 14.000 rpm durante 1 min a temperatura ambiente para sedimentar el cabello en polvo.
- Transferir 0,6 ml del sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml, teniendo cuidado de no alterar el sedimento de pelo en polvo.
4. Molienda de muestras y extracción CORT - Método 2 para muestras pequeñas
- Molienda de la muestra
- Coloque un máximo de 60 mg de cabello en un tubo de microcentrífuga de 2 ml previamente pesado reforzada para golpes de talón.
- Volver a pesar el vial para obtener el peso de la muestra.
- Agregue tres bolas de acero cromado de 3,2 mm a cada vial y luego moler la muestra por lo menos durante 2 minutos en un batidor de bolas. Si la inspección visual revela que la muestra se pulveriza insuficientemente, a continuación, realizar la molienda adicional para 0,5 o 1 min. Nota: No se necesita ninguna transferencia de los cabellos suelo en este caso porque la extracción CORT se realiza en el mismo vial como la molienda.
- Extracción de CORT
- Añadir 1,5 ml de metanol de grado HPLC al tubo de microcentrífuga que contiene la muestra en polvo.
- Tapar el tubo e incubar la muestra durante 18-24 horas a temperatura ambiente con inversión constante utilizando un rotador.
- Centrifugar los tubos a 10.000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar el cabello en polvo. Nota: Las perlas de acero cromo permanecen en el tubo con el cabello durante las etapas de extracción y centrifugación, que representa la velocidad de centrifugación más bajo en comparación con el método 1.
- Transferir 1,0 ml del sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml, teniendo cuidado de no alterar el sedimento de pelo en polvo.
5. La evaporación del disolvente y la reconstitución Muestra
- Se seca el metanol utilizando un evaporador de vacío o una corriente de gas nitrógeno si un evaporador de vacío no está disponible. Si se utiliza un evaporador de vacío, el vapor de metanol puede ser atrapado por mediode una trampa fría o una trampa químico equipado con un cartucho de carbón activado.
- Después de la eliminación del metanol, reconstituir el extracto de CORT en un volumen apropiado de tampón de ensayo EIA (diluyente de ensayo). Si se anticipan valores relativamente altos CORT, a continuación, utilizar un volumen de tampón de 0,4 ml o mayores. Si se anticipan valores relativamente bajos, a continuación, el volumen puede reducirse a 0,2 ml o menos para aumentar la sensibilidad. Nota: 0,2 ml de volumen es suficiente para ejecutar alícuotas duplicadas de la muestra al menos dos veces en caso de que se requiere una repetición de la muestra.
- Cualquiera de ensayo de la muestra reconstituida inmediatamente o congelar a -20 ° C para su posterior análisis. Nota: Si se congela la muestra reconstituida, es importante para evitar la sublimación durante el periodo de congelación desde una alteración en volumen de la muestra se lleva a un valor CORT falsa cuando se realizan los cálculos finales.
6. Ensayo CORT y conversión de datos
- Analice los extractos de pelo paraCORT utilizando una alta sensibilidad de inmunoensayo enzimático (EIA) kit. Nota: Si está usando un kit comercial salival CORT EIA, seguir las recomendaciones del fabricante, tal como se especifica en el prospecto del kit excepto que las muestras de prueba serán alícuotas duplicadas de cada extracto reconstituido el pelo en lugar de las muestras de saliva.
- Preparar un extracto de pelo de control de calidad (QC) para su uso en cada ensayo.
- Recoge una serie de muestras de cabello adicionales y, o bien procesar individualmente como en los pasos 4.1 y 4.2 o la piscina para ellos gran muestra la transformación que en los pasos 3.1 y 3.2.
- Se evapora el disolvente y reconstituir los extractos como en los pasos 5.1 y 5.2, a continuación, combinar los extractos reconstituidas a partir de varias muestras individuales o agrupados.
- Alícuota de un volumen adecuado del extracto reconstituido combinado (por ejemplo, 0,10 ml) en tubos de microcentrífuga individuales y congelar para su uso posterior.
- Descongelar y ejecutar una alícuota de control de calidad por duplicado en cada microplaca inmunoensayo para proporcionar una referencia valor CORT para comprobar la calidad de cada ejecución.
- Un intra-ensayo coeficiente de variación (CV; definido como la desviación estándar dividida por la media de un conjunto de valores de muestra) se puede calcular mediante el análisis de control de calidad 10-12 pozos en el mismo plazo, mientras que un inter-ensayo CV se puede calcular utilizando los valores de control de calidad a través de un grupo de carreras. Si uno de software de lector de microplacas calcula un CV de los pocillos duplicados en representación de cada extracto de cabello, y luego un método alternativo para la determinación de CV intra-ensayo consiste en calcular la media de los valores de CV individuales en toda la placa.
- Si cualquier extracto de la muestra se obtiene un resultado mayor que el estándar más alto CORT en el EIA, y luego otra alícuota del extracto se diluye con una cantidad apropiada de tampón de ensayo y la lectura posterior EIA se corrige por el factor de dilución. Las muestras también se volvieron a analizar de forma rutinaria si el CV de los pocillos duplicados es> 10%.
- Debido kits CORT EIA están diseñados para medir CORT vaLúes en muestras líquidas tales como la saliva o el plasma, la salida del software lector de microplacas debe ser convertido a cantidad de CORT por unidad de peso de pelo en polvo. La siguiente fórmula convierte la salida del ensayo en mg / dl a CORT pg por mg de cabello:
(A / B) * (C / D) * E * 10.000 = C
donde A = g / dl de salida de ensayo, B = peso (en mg) de cabello se sometió a extracción; C = vol. (En ml) de metanol añadido al cabello en polvo; D = vol. (En ml) de metanol recuperado a partir del extracto y se secó a continuación hacia abajo, E = vol. (En ml) de tampón de ensayo utilizado para reconstituir el extracto se secó, y F = valor final de la concentración de CORT pelo en pg / mg.
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Resultados
La figura 1 muestra la copia impresa de un conjunto representativo de muestras de cabello humano (varón adulto y sujetos humanos femeninos) procesado utilizando el método 2 de molienda y extracción. Los programas informáticos se utilizó para generar la salida de datos y para adaptarse a una curva sigmoidal de 4 parámetros a los estándares Cort (Figura 2). Los CV entre pocillos de esta placa variaron desde 0,01 hasta 5,73%, con un promedio de CV intraensayo de 1.34%. El CV inter-ensayo d...
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Discusión
El procedimiento CORT cabello descrito anteriormente es fácil de realizar, es relativamente barata, hace uso de productos químicos fácilmente disponibles, reactivos y suministros, y se necesita un equipo que, con una excepción, es probable que esté presente en un laboratorio de análisis típico. La excepción es un aparato de trituración tal como un molino de bolas o mini-BeadBeater. Tomamos nota de que algunos grupos de investigación pelos en muestras de cabello en fragmentos pequeños de aproximadamente 1 mm de longitud ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos Kymberlee O'Brien, Celia Moore y Edward Tronick (Departamento de Psicología de la Universidad de Massachusetts, Boston) para proporcionar las muestras de cabello humano analizados en este estudio, y Stephen Suomi y Amanda Dettmer (Laboratorio de Etología Comparada, NICHD) para proporcionando las muestras de pelo de mono rhesus. El desarrollo inicial y el uso continuo de este método ha sido apoyado por el NIH RR11122 a MAN
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Isopropanol de grado HPLC | Fisher | A451 | |
| Metanol de grado HPLC | Fisher | A452 | |
| Kits de ensayo de cortisol salival | Salimetrics | 1-3002 | Consulte el prospecto del kit del fabricante para obtener información sobre la sensibilidad y especificidad del ensayo |
| 15 ml Tubos de centrífuga con tapón de rosca de polipropileno | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1,5 ml Tubos de microcentrífuga Safe-Lock | Fisher | 05-402-25 | |
| 2,0 ml Tubos de microcentrífuga Safe-Lock | Fisher | 05-402-7 | |
| 2,0 ml XXTuff microviales reforzados | BioSpec | 330TX | Uso con mini-beadbeater |
| Perlas de acero cromado de 3,2 mm | BioSpec | 11079132c | Úselo con mini-beadbeater |
| Tarros de molienda de acero inoxidable de 10 ml | Retsch | 02.462.0061 | Uso con molino mezclador |
| Bolas de molienda de acero inoxidable de 12 mm | Retsch | 05.368.0037 | Uso con molino mezclador |
| Cartucho de carbón activado Savant Fisher | DTK120R | Uso con trampa química Savant | |
| Rotador para tubos de centrífuga de 15 ml | Fisher | S02135 | |
| Rotador para tubos de microcentrífuga | Fisher | NC9854190 | |
| Centrífuga de sobremesa para tubos de microcentrífuga | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 molino mezclador | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac Fisher | DNA120-115 | ||
| Savant trampa de vapor refrigerada | Fisher | RVT400-115 | |
| Trampa química Savant | Fisher | SCT120 | Alternativa a la trampa de vapor refrigerada |
| Lector | |||
| Lavadora de | |||
| microplacasMezclador | |||
| Pipeta | |||
| Balanza |
Referencias
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