Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

Resumen

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Resumen

En los últimos años, dos fotones de imágenes se ha convertido en una herramienta muy valiosa en la neurociencia, ya que permite la medición de crónica de la actividad de las células identificadas genéticamente durante comportamiento ^1-6. Aquí se describen los métodos para llevar a cabo de dos fotones en la corteza del ratón mientras el animal se desplaza un entorno de realidad virtual. Nos centramos en los aspectos de los procedimientos experimentales que son clave para obtener imágenes en un animal se comporta en un entorno virtual muy iluminada. Los principales problemas que se presentan en este montaje experimental que aquí la dirección estamos: minimizando los artefactos de movimiento relacionadas con el cerebro, reduciendo al mínimo la fuga de luz del sistema de proyección de realidad virtual, y minimizando el daño tisular inducida por láser. También proporcionamos software muestra para controlar el entorno de realidad virtual y de hacer el seguimiento de los alumnos. Con estos procedimientos y recursos debería ser posible convertir un microscopio de dos fotones convencional para su uso en comportarse ratones.

Introducción

Dos fotones de imágenes de los indicadores de calcio (genéticamente codificados como GCaMP5 ⁷ o R-GECO ^8, o colorantes sintéticos como OGB o Fluo4) ha emergido como un poderoso método para medir la actividad neuronal en ratones comportarse ^1-6. Se permite la medición simultánea de la actividad de cientos de células en acción cerca de un solo potencial de resolución, de hasta aproximadamente 800 m por debajo de la superficie del cerebro ^9,10. Por otra parte, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) la actividad neuronal se puede medir crónicamente ^5,11,12, y en tipos de células genéticamen....

Protocolo

Fueron aprobadas y realizadas de conformidad con las directrices del Departamento del Cantón de Basilea-Ciudad Veterinario Todos los procedimientos con animales.

1. Hardware y software de instalación

1. Dos fotones configuración microscopio de barrido:
   1. Utilice un láser infrarrojo pulsante como una fuente de iluminación (ancho de pulso <120 fs).
   2. Utilice una exploración de cabeza compuesto por un escáner de resonancia 8 o 12 kHz y un nivel galvanómetro Nota:. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 Hz a 750 x 400 píxeles. Una alta tasa de cuadros es fundamental para minimizar el movimien....

Resultados

La calidad de imagen en imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones de células marcadas con un GECI depende en gran medida de la calidad de la ventana de implante craneal. Dos semanas después de la inyección del virus de la ventana del cráneo deben ser inspeccionados para mayor claridad. No debe haber ningún tejido de granulación o recrecimiento del hueso visible (Figura 1A). Por otra parte, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer sin cambios y los límites de la vasculat.......

Discusión

La clave para el éxito de comportamiento de formación de imágenes de dos fotones es la estabilidad de la preparación de dos maneras:

1. En el transcurso de la implantación ventana días post, respuestas inflamatorias del tejido pueden conducir a la mejora de la formación de tejido de granulación y el cartílago que dificultar o incluso impedir formación de imágenes.
2. Durante el experimento, el cerebro tiene que ser lo suficientemente estable para evitar los artefactos de movimiento corrompa la señal de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos (diámetro = 3-5 mm)	Implante de ventana	Menzel
InSight DeepSee láser	Microscopio	Spectra-Physics
12 kHz Escáner de resonancia	Cambridge Technology	G1-003-30026	Microscopio
Galvometer	Cambridge Technology	G6215H	Microscopio
Digitalizador	National Instruments	NI 5772	microscopio
FPGA	National Instruments	Microscopio	PXIe 7965R
Tarjeta de adquisición	Microscopio	PCIe 6363	National
Instruments Filtro de emisión 525/50	Semrock	FF03-525/50-25	Microscopio
piezoeléctrico z-drive	Physikinstrumente	P-726.1CD	microscopio
para piezoeléctrico accionamiento	Physikinstrumente	E665 Microscopio LVPZT
Objective 16X, 0.8NA	Microscopio	Nikon	CFI75
Microscopio Femto	DHPCA-100
Tubo fotomultiplicador	Microscopio	Hamamatsu
Cámara USB sin filtro IR	ImagenSource	DMK22BUC03	seguimiento de
la pupilaObjetivo 50 mm	VisualizaciónSource	M5018-MP Seguimiento de	la pupila
Anillos adaptadores macro	ImagengSource	LAexSet	Seguimiento de la pupila
Ratón óptico de ordenador	Logitech	G500	Seguimiento de movimiento
Bola de espuma de poliestireno 20 cm	, p. ej. idee-shop.de	08797.00.15	entorno virtual
Proyector LED	Samsung	SP-F10M	virtual entorno
Tarjeta de adquisición	National Instruments	NI 6009	entorno virtual
Motor de juego		www.panda3d.org	entorno virtual
Biblioteca Numpy para Python		www.scipy.org	entorno virtual
Scipy librería para Python		www.scipy.org	entorno virtual
Controlador NI-DAQmx	National Instruments	www.ni.com	entorno virtual
Gel de ultrasonido	Dahlhausen	5701.0342.10	de imágenes

de Controlador de Amplificador de corriente Panda3D