Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

Resumen

Describimos un método para caracterizar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos del prosencéfalo utilizando un enfoque optogenético para fotoestimular poblaciones neuronales in vitro.

Resumen

El prosencéfalo sensorial está compuesto por tipos de células intrincadamente conectadas, cuyas propiedades funcionales aún no se han dilucidado completamente. La comprensión de las interacciones de estos circuitos del prosencéfalo se ha visto favorecida recientemente por el desarrollo de métodos optogenéticos para la modulación de la actividad neuronal mediada por la luz. Aquí, describimos un protocolo para examinar la organización funcional de los circuitos del prosencéfalo in vitro utilizando la fotoestimulación de barrido láser de la canalrodopsina, expresada optogenéticamente a través de la transfección mediada por virus. Este enfoque también explota la utilidad de la recombinación de cre-lox en ratones transgénicos para dirigir la expresión en tipos específicos de células neuronales. Después de la transfección, las neuronas se registran fisiológicamente en preparaciones de corte utilizando una pinza de parche de célula completa para medir sus respuestas evocadas a la fotoestimulación de escaneo láser de las fibras que expresan canalrodopsina. Este enfoque permite evaluar la topografía funcional y las propiedades sinápticas. Los correlatos morfológicos se pueden obtener mediante imágenes de la expresión neuroanatómica de las fibras que expresan canalrodopsina utilizando microscopía confocal del corte vivo o del tejido postfijado. Estos métodos permiten investigaciones funcionales de los circuitos del prosencéfalo que amplían los enfoques más convencionales.

Introducción

Los elaborados circuitos del prosencéfalo de los mamíferos plantean un desafío experimental para diseccionar los roles funcionales de sus componentes entrelazados. El desarrollo de métodos optogenéticos para excitar e inhibir específicamente las poblaciones neuronales y sus proyecciones^1-3 ha ayudado a desenredar estas relaciones. Estos enfoques hacen uso de la expresión genéticamente controlada de canales de membrana que responden a la luz^4-6. Cabe destacar que la canalrodopsina, un canal iónico activado por luz, despolariza las membranas neuronales después de la estimulación óptica, lo que conduce a la excitación de la neurona expresora y sus proyecciones^4,7. Por el contrario, la halorrodopina, una bomba de cloruro depuerta la luz, hiperpolariza la membrana, inhibiendo así la proyección dirigida^6,8,9. Se han diseñado varias variantes de estas opsinas, se han producido múltiples vectores para su transfección y expresión en poblaciones neuronales de interés, y se han diseñado líneas de ratones transgénicos que expresan constitutivamente estas opsinas o que permiten el control de su expresión mediado por cre-lox^1,2,10,11.

La utilidad de estos métodos y materiales optogenéticos ha revolucionado la neurociencia experimental moderna, permitiendo la disección del papel de circuitos neuronales específicos en la fisiología y el comportamiento del organismo^12-15. En particular, estos métodos pueden aplicarse poderosamente a la disección funcional de los circuitos cerebrales utilizando preparaciones de corte in vitro ^16-20. En este contexto, una de las principales ventajas de este método es la capacidad de caracterizar la fisiología de proyecciones de largo alcance que son difíciles, si no imposibles, de preservar en un corte grueso, como las conexiones comisurales entre los hemisferios corticales cerebrales¹⁶. Además, esta tecnología permite manipulaciones que no son posibles con otros métodos, como la inhibición selectiva de proyecciones con precisión temporal fina utilizando halorrodopsina^6,8,9. Además, la expresión específica del tipo celular de estas opsinas permite estimular o inhibir selectivamente componentes aislados en un circuito neuronal^1,2,11,15,21. Como tal, estas novedosas herramientas optogenéticas permiten el análisis sin precedentes de las contribuciones neuronales a la fisiología y el comportamiento.

Aquí, describimos un protocolo para expresar canalrodopsina en el cerebro de ratón utilizando vectores virales adenoasociados (AAV)^1,2. La transfección específica de las poblaciones neuronales objetivo se puede lograr utilizando este protocolo, con la elección adecuada de construcciones promotoras o ratones transgénicos que expresen Cre-recombinasa en las neuronas objetivo de interés y una construcción viral 'floxada'^1,11,15,21 (Figura 1). Como ejemplos aquí, examinamos las proyecciones corticocorticales entre la corteza visual primaria (V1) y la corteza visual secundaria (V2) y también investigamos la proyección corticotalámica de la capa 6 desde la corteza sensorial somadora primaria (S1) hasta el núcleo medial ventroposterior (VPm). Combinamos esta expresión específica con la fotoestimulación de escaneo láser in vitro para evaluar la fisiología sináptica y la topografía funcional. La configuración presentada aquí permite el posicionamiento espacial preciso y el control de los loci de la fotoestimulación. Por último, describimos la visualización de patrones de expresión mediante microscopía confocal.

Protocolo

1. Cirugía e inyecciones

1. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal (se recomienda una aguja de 22-25 g) de ketamina (100-120 mg/kg) y xilacina (7,5-16 mg/kg).
   1. Evalúe la sedación con pinzamientos fuertes en los dedos de los pies hasta que no se obtengan respuestas. Para todos los procedimientos con animales descritos, modifíquelos para seguir las pautas locales de IACUC según sea necesario.
2. Coloque los ratones sedados en un dispositivo estereotáxico asegurando la cabeza y las orejas en sus respectivos soportes.
   1. Lubrique los ojos antes de colocar al animal en el dispositivo estereotáxico con una pomada oftálmica estéril.
3. Afeita el cuero cabelludo con una navaja de afeitar y esteriliza la zona con hisopos Betadine.
4. Con un bisturí, haga una incisión en la línea media y refleje la piel y los músculos subyacentes por encima del área que se va a inyectar.
5. Gire la hoja de un bisturí como una trépano para realizar una craneotomía por encima de la región que se va a exponer. También puedes utilizar una pequeña broca acoplada a una Dremel para realizar la craneotomía.
   1. Para realizar la craneotomía, coloque la hoja de bisturí o la broca en la superficie del cráneo y gírela lentamente hasta que se haya excavado suficiente hueso para revelar la piamadre que se encuentra debajo.
   2. Una vez realizada la excavación inicial, agranda la craneotomía con pinzas finas para extraer cuidadosamente el hueso de los bordes.
6. Llene una jeringa de 1 μl con la solución viral que se va a inyectar (UNC Vector Core).
   1. Para mejorar la eficacia de la transfección, prepare una solución viral con 4 μg/ml de polibreno.
7. Baje la aguja en el área que se va a inyectar e infunda a presión 200 nl de solución que contenga virus con una bomba de jeringa.
   1. Deje reposar la jeringa durante 10 minutos antes de retirar la aguja.
8. Sutura la piel con nylon monofilamento no absorbible y cubre la incisión con ungüento antibiótico.
   1. Las suturas deben retirarse después de 7-10 días.
9. Inyectar buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para la analgesia postoperatoria.
10. Permitir que los animales se recuperen postoperatoriamente durante 14-21 días para permitir una expresión adecuada del canal rodopsina.

2. Preparación de rebanadas

1. Después del período de recuperación, anestesiar profundamente al animal con anestesia con isoflurano, como se verifica por la ausencia de reflejo de retirada cuando la pata trasera y/o los dedos del pie trasero están firmemente apretados.
2. Diseccionar el cerebro por decapitación seguida de cortes frontales y de línea media en el cráneo.
3. Separa el cráneo de la línea media para exponer el cerebro.
4. Extraiga con cuidado el cerebro con una espátula fina para separar los nervios craneales de la base del cerebro.
5. Coloque rápidamente el cerebro disecado en un vaso pequeño de 100 ml que contenga líquido cefalorraquídeo artificial frío y frío (ACSF; en mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 25 glucosa).
6. Extraiga el cerebro del ACSF y colóquelo en un portaobjetos de microscopio cubierto con papel de filtro prehumedecido con ACSF.
7. Haz un corte de bloqueo del cerebro en la orientación deseada con una cuchilla de afeitar limpia.
8. Fije la superficie bloqueada del cerebro a la etapa de corte con pegamento adhesivo instantáneo.
9. Transfiera la etapa a una cámara de corte de vibratomo (se mantiene en el congelador hasta que esté lista para cortar).
10. Vierta ACSF frío en la cámara de corte.
11. Corta secciones de cerebro a 400-500 μm con un cortador de tejido vibratorio.
12. Transfiera los trozos de cerebro a una cámara de retención que contenga ACSF oxigenado e incube a 30 °C durante al menos 1 hora antes del experimento.

3. Registro fisiológico

1. Después del período de incubación, transfiera una rebanada a una cámara de registro en una platina de microscopio modificada.
2. Asegure la rebanada en el baño durante el experimento usando algunos hilos de filamentos de nailon unidos a un soporte de rebanada de alambre de platino.
3. Perfunda la rebanada con ACSF constantemente.
4. Tire de las pipetas de registro hasta una resistencia de la punta de 3-6 MΩ cuando se llenen con una solución intracelular que contenga lo siguiente (en mM): 127 K-gluconato, 3 KCl, 1 MgCl₂, 0,07 CaCl₂, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. La solución intracelular debe tener un pH de 7,3, ajustado con KOH o ácido glucónico y una osmolalidad de 280-290 mOsm.
5. Utilizando una configuración de grabación de célula completa visualizada estándar, coloque la pipeta de grabación cerca de la neurona que se va a registrar mientras aplica presión positiva^22,23.
6. Libere la presión positiva mientras aplica la succión para formar un sello de Gigaohm.
7. Aplique una succión breve para romper la membrana y formar un registro de la configuración de la célula completa.
8. Registre las respuestas de las neuronas en voltaje o pinza amperimétrica.

4. Fotoestimulación con escaneo láser

1. Iniciar el software y hardware de adquisición de datos, descrito en los informes anteriores^23-29.
   Nota: Hemos utilizado los programas de adquisición Tidelwave²⁵ y, más recientemente, Ephus²⁶, escritos en Matlab y desarrollados por el laboratorio de Karel Svboda en Janelia Farms³⁰. Para una descripción completa de la fotoestimulación con escaneo láser en Ephus, consulte Suter et al.²⁶ y la guía paso a paso³⁰.
   Nota: La configuración descrita en este artículo se deriva de la descrita por Shepherd (2012)²³. El rayo láser es guiado a través de un sistema de espejos de haz abierto hasta el puerto superior del microscopio a través de la lente del objetivo en el corte (Figura 2).
2. Desvíe una pequeña porción del láser a un fotodiodo con un cubreobjetos de microscopio colocado en la trayectoria del láser y use la salida de corriente de este fotodiodo para monitorear la intensidad del láser durante los experimentos.
   1. Calibre la salida de corriente del fotodiodo registrada en el software a la potencia láser medida en el plano focal posterior del objetivo utilizando un medidor de potencia durante la configuración del equipo²³.
3. Controle la potencia del láser girando una rueda de densidad neutra variable. La potencia del láser utilizada varió entre 25 y 70 mW (en el plano focal posterior) en nuestros experimentos.
4. Establezca la duración y el tiempo de la estimulación láser modificando los parámetros de pulso para el láser y el obturador. La estimulación láser suele durar 2 mseg.
5. Capture la imagen de la región a estimular mediante la función 'Grab Video'.
6. Seleccione la rejilla de estimulación de acuerdo con las dimensiones deseadas. Por lo general, utilizamos una matriz de estimulación de 16 x 16 con un espaciado de 80 μm entre filas y columnas adyacentes.
7. Superponga la cuadrícula de mapeo con la imagen adquirida y ajuste el desplazamiento x, y y de grado a la ubicación y orientación deseadas.
8. Active la función 'Mapa' para iniciar la estimulación y la adquisición de datos.
9. Después de la adquisición de las respuestas evocadas por la fotoestimulación, lleve a cabo el análisis de los datos mapeados utilizando el programa de análisis de mapas fuera de línea en Tidelwave²⁵ o el programa 'MapAnalysis' en Ephus²⁶.

5. Imágenes de corte fijo

1. Después de los registros, transfiera el corte de cerebro al 4% de paraformaldehído (PFA) en 0,01 M PBS (pH7,4) durante la noche a 4 ºC.
2. Transfiera la rodaja en sacarosa al 30% en PFA al 4%/0,01 M PBS durante la noche a 4 ºC.
3. Corte secciones de 50 μm con un criostato y recoja en PBS de 0,01 M.
4. Enjuague las secciones en 0.01 M PBS dos veces a temperatura ambiente.
5. Monte las secciones y el cubreobjetos en un medio antidecoloración adecuado.
6. Transfiera las secciones al microscopio confocal.
7. Concéntrese en el retorno de la inversión utilizando luz blanca.
8. Elija la longitud de onda, el tamaño de la imagen y la repetición para la adquisición de imágenes. Para YFP, usamos 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Resultados

La fotoestimulación con escaneo láser de las proyecciones entre el área visual primaria (V1) y el área visual secundaria (V2) en el ratón se logró después de las inyecciones de pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP en V1 de un ratón Balb/C (Figura 3). El promotor de CaMKIIa en esta construcción viral impulsa la expresión específica de canalrodopsina-EYFP en neuronas glutamatérgicas excitadoras^1,15. Después de la preparación de los cortes para el registro fisiológico, se observó la expresión de las fibras de canalrodopsina-EYFP, es decir, la epifluorescencia del EYFP conjugado, que atravesaba de V1 a V2 (Figura 3A). Además, también se observaron las fibras corticotalámicas en el núcleo geniculado lateral (LGN) (Figura 3A). Las grabaciones de pinzamiento de parche de célula completa de una neurona en V2 revelaron EPSC provocadas después de la fotoestimulación de escaneo láser de fibras que expresan canalrodopsina-EYFP en las capas inferiores de V2 (Figura 3B).

En otro ejemplo, la fotoestimulación con láser de las proyecciones corticotalámicas desde la capa 6 de la corteza somatosensorial primaria (S1) hasta el núcleo ventroposterior (VP) se llevó a cabo utilizando este protocolo. Aquí, utilizamos un enfoque de Cre-Lox para dirigirnos específicamente a la expresión de canalrodopsina en las neuronas de la capa 6 y las proyecciones corticotalámicas de interés. Explícitamente, inyectamos pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA en S1 de B6. Ratones Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figuras 1 y 4). Esta cepa de ratón transgénica expresa Cre-recombinasa específicamente en las neuronas corticotalámicas de la capa^{6 21} y, por lo tanto, da lugar a la expresión de ChR-YFP solo en aquellas neuronas después de la transfección por la construcción AAV 'floxada'. Después de la preparación de los cortes, se observaron fibras de canalrodopsina-EYFP en las neuronas de la capa 6 y fibras que se proyectan a la capa 4 y VP (Figuras 4A y 4B). El registro fisiológico de una neurona VPm utilizando una pinza de parche de célula completa reveló que las EPSC podían obtenerse después de la fotoestimulación de escaneo láser cerca de la neurona registrada (Figuras 4C y 4D).

La morfología de las fibras marcadas se evaluó más fácilmente siguiendo los registros fisiológicos. Aquí, reseccionamos preparaciones de corte (50 μm) con expresión de canalrodopsina-EYFP en neuronas corticotalámicas de capa 6 (Figura 5). Esto reveló un patrón fino de fibras marcadas que atraviesan desde la capa 6 hasta la capa 4, donde terminaban y arborizaban extensamente (Figura 5A). Además, se observaron fibras corticotalámicas que entraban en la sustancia blanca viajando hacia el tálamo (Figuras 5A y 5B).

Figura 1. Ilustración esquemática de la expresión dirigida de canalrodopsina a través de un enfoque Cre-Lox. A los ratones transgénicos que expresan Cre-recombinasa en las poblaciones neuronales de interés se les inyecta un virus "floxed" que codifica canalrodopsina fusionada con una proteína fluorescente, como YFP. Después de la transfección, solo las neuronas con Cre-recombinasa expresarán canalrodopsina-EYFP. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Ilustración esquemática de la configuración de la fotoestimulación. (A) Diagrama de la configuración de la fotoestimulación de escaneo láser. El rayo láser es guiado sucesivamente a través de un sistema de haz abierto hasta un obturador y un filtro de densidad neutra (N.D.). Un cubreobjetos refleja parte del haz a un fotodiodo conectado a un amplificador para mediciones de potencia láser. Los galvanómetros de espejo se utilizan para posicionar el rayo láser a través de una lente de escaneo, que guía el haz a través de un puerto lateral en la parte superior del microscopio. A continuación, el haz se refleja a través de la lente del objetivo hasta la preparación del corte mediante un espejo dicroico. Para más detalles, véase Lam y Sherman²³ y Shepherd²⁹. (B) Ejemplo del patrón de cuadrícula de fotoestimulación para el experimento representativo que se muestra en la Figura 3. La rejilla de estimulación de 16 x 16 se superpone a una fotomicrografía de la preparación del corte. Una estrella roja indica la ubicación de una neurona registrada mediante una pinza de parche de célula completa. La posición del rayo láser se guía a cada una de las 256 posiciones de la rejilla de estimulación mediante el posicionamiento computarizado de los galvanómetros de espejo. En la figura se muestran las posiciones del láser de los 5 primeros puntos de estimulación. Las respuestas de la neurona registrada a la fotoestimulación en cada uno de los sitios se muestran en la Figura 3. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Fotoestimulación láser de las proyecciones corticocorticales de la corteza visual primaria (V1) a la corteza visual secundaria (V2) en el ratón. (A) Imagen epifluorescente de la preparación del corte que muestra fibras de canalrodopsina-EYFP de V1 a V2 y en el núcleo geniculado lateral (LGN). La expresión específica de canalrodopsina-EYFP en neuronas glutamatérgicas excitadoras está impulsada por una construcción viral que contiene el promotor CaMKIIa. (B) Corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC) provocadas por una neurona en V2 después de la fotoestimulación de escaneo láser. La estrella roja indica el lugar de grabación. Barras de escala: (A) 500 μm, (B) 200 pA, 100 mseg. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Fotoestimulación láser de las proyecciones corticotalámicas desde la corteza somatosensorial primaria (S1) hasta el núcleo ventroposterior (VP) en el ratón. (A) Imagen epifluorescente de la preparación del corte que muestra fibras de canalrodopsina-EYFP en S1. (B) Imagen epifluorescente de fibras marcadas en VP. (C) Corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC) provocadas por una neurona VP después de la fotoestimulación de escaneo láser. (D) Gráfico de las EPSC medias. La estrella roja indica el lugar de grabación. Las trazas en caja en (C) se corresponden con los valores en caja en (D). Barras de escala: (A) 250 μm, (B) 250 μm, (C) 100 pA, 100 mseg. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5: Imagen de las neuronas de la capa 6 que expresan canalrodopsina-EYFP en la corteza somatosensorial primaria (S1) del ratón. (A-B) Neuronas marcadas en la capa 6 y fibras que se proyectan a la capa 4 y a la sustancia blanca. Barras de escala: (A) 250 μm, (B) 250 μm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discusión

El protocolo descrito detalla un enfoque para la evaluación in vitro de la topografía funcional y la fisiología de los circuitos neuronales, que no se limita a la investigación de los circuitos del prosencéfalo, es decir , los del tálamo y la corteza. Se han puesto a disposición de la comunidad científica varias construcciones virales para la transfección optogenética y se pueden obtener fácilmente del UNC Vector Core. Para obtener una descripción de las construcciones virales fácilmente disponibles, consulte el UNC Vector Core³¹, la página de recursos de optogenética en el Laboratorio Deisseroth de la Universidad de Stanford³² y el laboratorio de neurobiología sintética Boyden en MIT³³. Estos laboratorios han desarrollado variantes de estas opsinas y permiten una amplia gama de modos para controlar la excitabilidad neuronal^1,2. La obtención de estos vectores del núcleo de vectores de UNC requiere un Acuerdo de transferencia de material de los laboratorios de origen. En este protocolo, observamos que la adición de polibeno mejora la eficacia de la transfección. Además, otra variable que influye en la expresión es el período de recuperación posquirúrgica, en el que observamos que un período de al menos 14 días es suficiente para obtener una expresión robusta en las vías del prosencéfalo de los ratones.

Para la transfección dirigida de grupos neuronales específicos, se han desarrollado varias líneas de ratones transgénicos Cre, que se pueden utilizar en combinación con construcciones virales de marco de lectura abierto inverso 'floxed' que se han desarrollado¹¹. Varias cepas pertinentes a la investigación en neurociencia están disponibles a través de los Centros Regionales de Recursos de Ratones Mutantes³⁴. Los atlas de los patrones de expresión de Cre-recombinasa en estas líneas transgénicas se ofrecen a través de la base de datos GENSAT³⁵. Además, Jackson Labs ofrece varias cepas Cre-transgénicas, así como otras que expresan constitutivamente opsinas en grupos neuronales específicos. Un paso crítico para utilizar estas líneas de ratones es tener en cuenta el tiempo necesario para obtener y establecer una colonia de reproducción, que puede variar según la cepa particular de interés.

Para la fotoestimulación, hemos utilizado y adaptado la configuración desarrollada por el Shepherd Lab de la Universidad Northwestern, descrita en un protocolo reciente²⁹. Aunque está optimizado para el desbloqueo de glutamato, esta configuración también es susceptible de fotoestimulación de canalrodopsina sin modificaciones. Esta configuración permite un control espacial preciso y el posicionamiento de los loci de fotoestimulación, lo que permite una evaluación de la topografía funcional de la inervación de canalrodopsina de las neuronas registradas. Aunque el control espacial se mejora con este método de fotoestimulación, es más costoso que los métodos que utilizan iluminación de campo basada en LED²⁰. Además, la falta de uniformidad del tejido cerebral es una limitación de la optogenética o de cualquier técnica que implique la manipulación de la luz. Sin embargo, en la práctica, rara vez es un factor, ya que los resultados se interpretan principalmente de manera cualitativa. En caso de que se necesite una comparación más cuantitativa entre las regiones del cerebro, siempre se puede usar la máxima intensidad de luz para lograr respuestas "saturadas".

Además, hemos utilizado los programas de software Tidelwave y Ephus escritos en Matlab para controlar la fotoestimulación de escaneo láser y la adquisición de datos^25,26. Sin embargo, se recomienda que aquellos que configuren un sistema similar empleen el software Ephus²⁶ más nuevo, que tiene soporte disponible a través del sitio de desarrollo de Janelia Farms³⁰. Un paso clave es elegir cuál de estos paquetes de software utilizar, ya que sus requisitos de hardware difieren ligeramente. Además, los programas de análisis de mapas se adaptan a sus respectivos programas de adquisición de datos.

Varios de estos pasos se pueden modificar para adaptarse a la configuración particular del profesional. Las inyecciones de soluciones virales se pueden realizar con mecanismos de administración además de una jeringa, por ejemplo , las pipetas de vidrio capilares extraídas a diámetros de punta de ~40 μm también funcionan bien. Para las cirugías, se puede sustituir por un soporte de cabeza no estereotáxico si tales coordenadas no son necesarias para guiar las inyecciones. Además, las composiciones de ACSF y soluciones intracelulares pueden modificarse en función de los requisitos experimentales particulares, por ejemplo , sustituyendo una solución intracelular de cesio o cloruro para aislar las corrientes inhibitorias. Además, una alternativa a la obtención de imágenes de patrones de expresión en cortes fijos también se puede realizar en el corte vivo en un equipo de imágenes adecuado con un sistema de perfusión por baño.

En resumen, este protocolo permitirá al médico caracterizar la topografía funcional y la fisiología sináptica de las proyecciones in vitro, lo que puede no ser posible utilizando métodos estándar, p. ej. caracterización de proyecciones de largo alcance que no se pueden conservar en un corte. El protocolo de transfección descrito se puede aplicar a experimentos optogenéticos in vivo ^1-3,12,14, ya que el mecanismo de administración es el mismo. Finalmente, aunque este protocolo describe la transfección de ratones, muchos de los vectores virales disponibles se pueden usar para transfectar y expresar teóricamente estas opsinas en una amplia gama de especies de mamíferos, lo que permite una gran cantidad de estudios comparativos y específicos de especies^1-3.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polybrene	Santa Cruz Biotech	SC134220
Solución de paraformaldehído al 32%	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV construcciones virales	UNC Vector Core	NA
Mouse Cabezal estereotáctico	Stoelting	51730
Inyector Nanocool	Harvard Aparato	703040
Láser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;	DPSS Lasers, Inc	3500
Galvonomómetros	Cambridge Scanning	6210
espejos	Cambridge Scanning	6m2003S-A
montura	Cambridge Scanning	6102103L
cable	Cambridge Scanning	6010-19-120
controlador/controlador	Cambridge Scanning	67121-1
Obturador - Recubrimiento ZM (compatible con UV)	Uniblitz	L23-ZM2
Controlador de obturador	Uniblitz	VMM-D1
Amplificador de corriente	Stanford Research Systems	SR570
6713 placa	National Instruments	777741-01
2110 caja de conexiones	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
Cables	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems