In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Resumen

Aquí describimos un procedimiento para obtener imágenes de complejos virales en líquido a resolución nanométrica utilizando un microscopio electrónico de transmisión.

Resumen

Los investigadores utilizan regularmente microscopios electrónicos de transmisión (MEE) para examinar las entidades biológicas y evaluar nuevos materiales. Aquí, describimos una aplicación adicional para estos instrumentos: ver conjuntos virales en un ambiente líquido. Este método emocionante y novedoso de visualizar estructuras biológicas utiliza un soporte de espécimen a base de microfluídicos recientemente desarrollado. Nuestro artículo en video demuestra cómo ensamblar y usar un soporte microfluídico para obtener imágenes de especímenes líquidos dentro de un TEM. En particular, utilizamos partículas de doble capa (DLPs) de rotavirus simios como nuestro sistema modelo. También se describen los pasos para recubrir la superficie de la cámara líquida con biopelículas de afinidad que atar DLPs a la ventana de visualización. Esto nos permite obtener imágenes de ensamblajes de una manera que es adecuada para la determinación de la estructura 3D. Por lo tanto, presentamos una primera visión de partículas subvirales en un ambiente líquido nativo.

Introducción

Un objetivo común de los biólogos e ingenieros es comprender el funcionamiento interno de las máquinas moleculares. Los microscopios electrónicos de transmisión (TEMs) son instrumentos ideales para visualizar estos intrincados detalles a una resolución casi atómica^1-2. Con el fin de sostener el sistema de alto vacío de un TEM, las muestras biológicas se incrustan típicamente en películas delgadas de hielo vítreo^3,azúcares^4,sales de metales pesados^5,o alguna combinación de las mismas^6. Como resultado, las imágenes de especímenes incrustados pueden revelar sólo instantáneas limitadas de procesos dinámicos.

Protocolo

1. Preparar dispositivos de captura de afinidad¹⁶

1. Limpie los E-chips de nitruro de silicio incubando en 15 ml de acetona durante 2 min seguidos de 15 ml de metanol durante 2 min(Figura 1A). Deje que las virutas se sequen bajo el flujo de aire laminar.
2. Incube las virutas secas en una placa de agitación calentada (sin agitar) durante 1,5 horas a 150 °C, luego déjenlas enfriar a temperatura ambiente antes de usarlas.
3. Utilice jeringas Hamilton para componer mezclas de lípidos en pequeños tubos de vidrio para contener 25% de cloroformo, 55% dlpc (1,2-dilauroil-fosfocolina) en clorof....

Resultados

Las imágenes representativas de DLPs en líquido utilizando E-chips que fueron descargados por resplandor (Figura 3A) muestran menos DLPs en un área de visualización dada, presumiblemente debido a la difusión, en comparación con los DLPs que se enriquecen en dispositivos affinity capture (Figura 3B). La adición de formiato de uranilo en la cámara de imágenes mejora el contraste de la muestra y, por lo tanto, la visibilidad de los DLPs individuales en solución(Figura 3C,pa.......

Discusión

En nuestro trabajo presentado, empleamos el acercamiento de la captura de la afinidad a la correa rotavirus DLPs a una plataforma microfluidic. Esto permitió la proyección de imagen in situ de complejos macromoleculares en un microambiente líquido. El enfoque de captura es significativo con respecto a otras técnicas de imagen microfluídicas porque localiza especímenes biológicos a la ventana de imágenes para negar los grandes problemas difusivos que surgen al grabar imágenes en líquido. Sin embar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E-chips, chip espaciador	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μ m x 50 μ m ventana
E-chip, chip superior	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μ m x 50 μ m ventana
Lípido Ni-NTA	Avanti Lípidos Polares	790404P	Forma de polvo
DLPC (12:0) lípido	Avanti Lípidos Polares	850335P	Forma de polvo
Matraces volumétricos	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Jeringas Hamilton	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 y mu; l; 1-25 y mu; l
Papel de filtro Whatman #1	Whatman	1001 090	100 piezas, 90 mm
Placas de Petri de vidrio	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Pipetas Pasteur de vidrio	VWR	14673-010	14673-010
Tubos de cultivo de vidrio	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetona	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Metanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Cloroformo	Ciencias de la Microscopía Electrónica	12550	100 ml
Su etiqueta Proteína A Abcam	, Inc.	ab52953
Sistema de agua Milli-Q	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Agua Ultrapura
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipo
Poseidón In situ portamuestras	Protochips, Inc.		Compatible con
FEI FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		Cámara
CCD Eagle 2k HS	FEI Co.		10  Muestreo de píxeles en la
estación de bombeo seco Gatan 655 de	Gatan, Inc.		Punta del soporte de la bomba a 10-6  range
PELCO easiGlow, unidad de descarga incandescente	Ted Pella, Inc.		Modo de polaridad negativa
Placa de agitación calentada Isotemp	Fisher Scientific		Heat a 150 º C durante 1,5 horas

de 10 mg de 120 kV 30,000X