El laberinto de agua radial de ocho brazos está diseñado para evaluar el rendimiento de la memoria de referencia y de trabajo simultáneamente al requerir que los sujetos usen señales extra-laberinto para localizar plataformas de escape y remedia las limitaciones observadas en los diseños de laberintos de brazos radiales terrestres.
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Artículo de método
Uso de un laberinto acuático radial de ocho brazos para evaluar la memoria de trabajo y de referencia después de una lesión cerebral neonatal
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Resumen
Resumen
La memoria de trabajo y de referencia se evalúan comúnmente utilizando el laberinto de brazo radial terrestre. Sin embargo, este paradigma requiere entrenamiento previo, privación de alimentos y puede introducir confusiones en las señales de olor. El laberinto acuático radial de ocho brazos está diseñado para evaluar el rendimiento de la memoria de referencia y de trabajo simultáneamente al requerir que los sujetos utilicen señales extra-laberinto para localizar plataformas de escape y remedia las limitaciones observadas en los diseños de laberintos de brazos radiales terrestres. En concreto, se requiere que los sujetos eviten los brazos utilizados previamente para la evacuación durante cada día de prueba (memoria de trabajo), así como que eviten los brazos fijos, que nunca contienen plataformas de evacuación (memoria de referencia). Las reentradas en brazos que ya se han utilizado para escapar durante una sesión de prueba (y por lo tanto se ha eliminado la plataforma de escape) y las reentradas en brazos de memoria de referencia son indicativas de déficits de memoria de trabajo. Alternativamente, las primeras entradas en los brazos de memoria de referencia son indicativas de déficits de memoria de referencia. Utilizamos este laberinto para comparar el rendimiento de ratas con lesión cerebral neonatal y controles simulados después de la inducción de hipoxia-isquemia y mostramos déficits significativos tanto en la memoria de trabajo como en la de referencia después de once días de pruebas. Este protocolo podría modificarse fácilmente para examinar muchos otros modelos de deterioro del aprendizaje.
Introducción
La memoria de trabajo (WM) corresponde a un dominio cognitivo crítico requerido para la representación de objetos o lugares durante el comportamiento dirigido a objetivos1. Alternativamente, se requiere memoria de referencia (RM) para representaciones temporalmente estables de esos objetos o lugares. La memoria de trabajo y de referencia se ha evaluado durante mucho tiempo en roedores utilizando paradigmas de laberinto de brazo radialterrestre 2,3. Sin embargo, estas tareas con frecuencia requieren entrenamiento previo, ya que las ratas no están predispuestas a correr espontáneamente por laberintos. Esto puede aumentar significativamente el tiempo necesario para completar un experimento y puede interferir con los diseños longitudinales sensibles al tiempo. Otras limitaciones del laberinto terrestre de ocho brazos incluyen los requisitos de privación de alimentos y la dificultad para controlar los cambios en las señales de olor que quedan en el laberinto después de cada prueba. Muchas de estas limitaciones se han superado mediante el uso del paradigma del laberinto acuático de Morris4, sin embargo, históricamente estos diseños se han limitado a probar la memoria de referencia y el aprendizaje espacial (excepciones5-9). El laberinto de agua radial de ocho brazos es una versión modificada del laberinto de tierra radial de ocho brazos, que se ha utilizado para evaluar tanto la memoria de referencia como la de trabajo en ratas y ratones5-7. A diferencia de los laberintos terrestres tradicionales, el laberinto acuático radial de ocho brazos no requiere privación de alimentos, minimiza las posibles señales olfativas confusas y utiliza la motivación de los sujetos para escapar como un medio eficaz para evaluar el aprendizaje y la memoria de trabajo y referencia simultáneamente sin la necesidad de un entrenamiento previo5-7.
Una aplicación de este paradigma es evaluar los déficits de memoria de trabajo después de una lesión cerebral neonatal. La investigación en humanos ha demostrado que los bebés prematuros con riesgo de lesión cerebral exhiben déficits de memoria de trabajo más adelante en la vida10,11. La lesión cerebral neonatal puede modelarse en roedores mediante la inducción de hipoxia/isquemia (IH) en las primeras etapas del desarrollo postnatal12-15. Más importante aún, los déficits de aprendizaje espacial y memoria de trabajo encontrados en lactantes en riesgo son paralelos en los roedores que utilizan el laberinto acuático del brazo radial, lo que lo convierte en un modelo robusto para el estudio de tales deficiencias8,9. El laberinto de agua radial de ocho brazos también permite la cuantificación simultánea de la memoria de referencia y de trabajo, lo que lo hace ideal para la comparación de sujetos con y no lesiones cerebrales en modelos sensibles al tiempo (es decir, durante el desarrollo discreto) o para diseños longitudinales contrabalanceados.
En este protocolo, describimos los procedimientos de prueba utilizando un laberinto de agua radial de ocho brazos (ver Figura 1) y datos de ejemplo para ratas con y sin lesión hipóxico-isquémica neonatal. Se indujo hipoxia-isquemia (IH) el día 7 postnatal tras la cauterización de la arteria carótida común derecha y 120 min de exposición al oxígeno al 8%. Este procedimiento quirúrgico se ha utilizado ampliamente para modelar la patología de la prematuridad y la lesión cerebral neonatal (para más detalles, ver 12,13,16,17). Demostramos que el paradigma del laberinto acuático del brazo radial revela déficits en la memoria de referencia y en las capacidades de la memoria de trabajo después de una lesión neonatal por HI. En el protocolo actual, la memoria de referencia se evalúa utilizando cuatro brazos específicos del laberinto de agua radial de ocho brazos, que permanecen constantes a las señales adicionales del laberinto a lo largo de las pruebas. Estos brazos nunca contienen una plataforma de escape, por lo tanto, las entradas de los sujetos en estos brazos reflejan un rendimiento deficiente de la memoria de referencia y déficits en el aprendizaje a largo plazo. Los cuatro brazos restantes contienen plataformas de escape al comienzo del día, sin embargo, cada plataforma se retira una vez que el animal ingresa con éxito a un brazo y escapa del agua5-7. Esto requiere que el animal recuerde qué brazos entró durante las cuatro pruebas sucesivas, lo que aumenta la demanda de memoria de trabajo a medida que se elimina cada plataforma adicional. La memoria de trabajo se evalúa examinando las reentradas en los brazos utilizados previamente para escapar dentro del mismo día de la prueba o las reentradas en los brazos de memoria de referencia. Además, este diseño utiliza señales extra-laberínticas para ubicar las plataformas de escape que reflejan el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo. Este método para evaluar los errores de memoria de trabajo y de referencia fue utilizado originalmente por Jarrard et al.18 y desde entonces se ha utilizado ampliamente para evaluar modelos de roedores de trastornos neurológicos relacionados con el envejecimiento, discapacidades de aprendizaje y manipulaciones hormonales posteriores5,6,7,19,20.
El objetivo principal de este paradigma es evaluar la referencia y la memoria de trabajo, por lo tanto, el diseño del laberinto de agua radial de ocho brazos no debe limitarse para evaluar los déficits debidos a lesiones cerebrales del desarrollo. En cambio, estudios previos que utilizan este paradigma muestran que se puede evaluar una variedad de modelos de roedores para evaluar la patología del aprendizaje y la memoria en muchos contextos experimentales5,6,7,18,19,20.
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Rhode Island College y se adhieren a la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Configuración del laberinto
- Coloque señales claras, estáticas y salientes extra-laberinto (formas pintadas, muebles u otras características de la habitación estacionaria) alrededor del laberinto.
Nota: Cualquier señal de laberinto adicional debe permanecer en la misma ubicación durante la duración del experimento. - Coloque el cubo y los brazos del laberinto de brazos radiales en una tina de plástico (consulte la tabla de equipos, por ejemplo).
Nota: El laberinto utilizado en este protocolo consta de ocho brazos extraíbles de acero inoxidable unidos a ocho soportes centrales fijados a una base circular de acero inoxidable que se ha pintado de negro (consulte la Figura 1 para ver el diagrama y las dimensiones correspondientes). La tina de plástico ejemplificada en la Figura 1 tiene un diámetro interior de 122 cm y una altura de 60 cm. - Llene la bañera con agua calentada a temperatura ambiente (22-26 °C)7.
- Coloque plataformas a 1 cm por debajo de la superficie del agua en los extremos de cuatro de los ocho brazos.
Nota 1: Para cada sujeto, las ubicaciones de las plataformas son fijas durante la duración de la prueba. Independientemente de la configuración, se debe tener cuidado de evitar la colocación de las plataformas en más de dos brazos adyacentes (no se deben ubicar más de dos plataformas en brazos adyacentes). No coloque una plataforma en el brazo de inicio.
Nota 2: Las plataformas ocultas deben estar pintadas del mismo color que el inserto del laberinto para mezclarse con el fondo del laberinto.
2. Transferencia de sujetos para la prueba
- Transfiera a los sujetos del vivero a la sala de pruebas manteniendo el orden de prueba designado.
Nota: Los animales deben colocarse en una jaula opaca para ayudar a reducir el estrés anticipatorio y evitar que se vean las señales de la sala de pruebas. - Una vez en la sala de pruebas, coloque todas las jaulas opacas del grupo 1 en un banco o mesa de preparación manteniendo el orden de prueba.
Nota: En un estudio grande (por ejemplo, 30 sujetos) puede ser mejor dividir a los sujetos en grupos de prueba (por ejemplo, 3 grupos de 10 sujetos cada uno). Esto dependerá del tamaño de su sala de pruebas y de la viabilidad del transporte de los sujetos.
3. Protocolo de tableta digital para registrar las entradas del brazo del laberinto
- Abra un programa de grabación de PDF en la tableta digital.
- Importar todas las plantillas de registro de datos preguardadas para las asignaturas del grupo 1.
Nota: Cada plantilla de grabación debe guardarse previamente y etiquetarse con números específicos de tema y ensayo (por ejemplo, asunto 1_trial 1, asunto 1_trial 2, etc.) con un total de cuatro plantillas para cada tema (ensayos 1-4). La plantilla debe tener una representación en blanco de las ubicaciones del laberinto y la plataforma, así como un lugar para registrar el número de sujeto, el número de prueba, el día de la prueba, la plataforma de escape utilizada y la latencia de la prueba (consulte la Figura 2). - Abra la plantilla para la primera prueba de su primer sujeto.
Nota: Este sistema también se puede utilizar con plantillas de papel para investigadores sin acceso a tabletas o programas de toma de notas basados en tabletas.
4. Prueba de laberinto acuático de brazo radial
- Si los animales están alojados en parejas, separe a los sujetos antes de la sesión de prueba. Transfiera el primer sujeto de prueba a una jaula de calentamiento opaca separada.
Nota: La jaula debe calentarse a 37 °C con una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal entre los ensayos de prueba. - Antes de la primera prueba de cada sujeto, confirme que el número de identificación del sujeto coincida con el número de sujeto en la hoja de registro de datos y asegúrese de que las plataformas estén colocadas correctamente en el laberinto de agua de ocho brazos.
- Coloque el sujeto en el brazo de inicio frente a la pared del laberinto e inicie el temporizador.
Nota: Este protocolo fue diseñado para dos experimentadores, uno para registrar los datos y otro para manejar los sujetos. Durante esta colaboración, la comunicación entre los experimentadores es primordial. Es esencial la confirmación de las horas de inicio, los números de asignatura y la ubicación adecuada de la plataforma antes de cada prueba. - Permanezca inmóvil durante cada prueba en una posición designada en la sala para mantener la consistencia de la señal durante cada prueba.
Nota: Se debe tener cuidado de evitar las señales salientes (por ejemplo, perfumes) durante los experimentos y los experimentadores deben usar las mismas prendas (batas de laboratorio) todos los días para mantener la consistencia de las señales. - Registre cada entrada en un brazo colocando una marca en el brazo correspondiente en la plantilla de grabación en la tableta digital.
Nota: Una entrada se produce cuando los hombros de un sujeto rompen el plano de apertura del brazo. - Espere un máximo de 120 segundos para que el sujeto localice una de las cuatro plataformas. Una vez que el animal llega a la plataforma, detenga el temporizador, la prueba está completa.
Nota: Para mantener la consistencia, se dice que un sujeto ha alcanzado el objetivo cuando sus patas delanteras están en la plataforma. - Si el sujeto no puede localizar la plataforma en 120 segundos, guíalo cuidadosamente a la plataforma más cercana y permítele permanecer en la plataforma durante 10 segundos antes de retirarlo para asegurarte de que el animal esté al tanto de la ubicación objetivo.
- Solo el primer día, permita que el sujeto se siente en la plataforma durante 10 segundos después de cada una de las cuatro pruebas para que el sujeto pueda hacer referencia a las señales espaciales.
- Una vez finalizado el ensayo, retire al sujeto de la plataforma levantándolo suavemente por el cuerpo.
- Inicie el temporizador para el intervalo entre juicios de 90 segundos.
- Vuelva a colocar al sujeto en la jaula individual sobre la almohadilla de termorregulación.
- Registre la plataforma específica utilizada para el escape encerrando en un círculo la ubicación correspondiente en la plantilla de registro de datos.
- Durante este intervalo, retire la plataforma de escape utilizada por el sujeto en el ensayo anterior.
- Abra la plantilla para la siguiente prueba y marque todas las plataformas que el sujeto haya utilizado para escapar y, por lo tanto, haya eliminado durante las pruebas anteriores, con un X.
Nota: Marcar todas las plataformas que faltan antes de una prueba posterior es fundamental para definir los tipos de error (por ejemplo, memoria de referencia y/o memoria de trabajo correcta). - Antes de comenzar una prueba posterior, confirme el número de sujeto, el número de prueba y las ubicaciones de plataforma restantes.
- Una vez transcurrido el intervalo de 90 segundos entre ensayos, coloque al sujeto en el brazo de inicio frente a la pared del laberinto e inicie el temporizador para el siguiente intento.
- Repita este proceso para las pruebas 2 a 4, quitando la plataforma de escape alcanzada después de cada prueba y marcando la plantilla adecuadamente durante y después de cada prueba (es decir, coloque y X sobre las plataformas retiradas, indique los brazos ingresados y rodee la plataforma utilizada para escapar).
- Una vez que se hayan completado las cuatro pruebas de un sujeto, vuelva a colocar las plataformas de escape en los brazos apropiados del laberinto y repita el proceso de prueba para el siguiente sujeto (pasos de prueba 4.1-4.17).
- Una vez finalizada la prueba para el grupo 1, exporte las hojas de registro de datos a una carpeta para ese día de prueba (por ejemplo, el día 1) y guárdela en un sistema de almacenamiento de archivos.
Nota: Las hojas de registro de datos deben exportarse antes de comenzar el siguiente grupo de prueba para minimizar la posibilidad de pérdida de datos. - Repita para cada grupo (pasos de prueba 2.1-4.19).
5. Variables dependientes
- Para cada prueba, cuente el número de primeras entradas y repetidas en cualquier brazo que anteriormente tuviera una plataforma. Esto se indicará con una X sobre la plataforma en la hoja de registro de datos. Estos son los errores correctos de la memoria de trabajo.
Nota: Debido a que los errores de corrección de la memoria de trabajo dependen de recordar la ubicación de una plataforma que ya se ha utilizado para escapar y evitar ese brazo, no puede tener un error de corrección de la memoria de trabajo en el primer intento. - Para cada ensayo, cuente el número de primeras entradas en cualquier brazo que nunca haya contenido una plataforma de la hoja de registro de datos. Se trata de errores de memoria de referencia.
- Para cada ensayo, cuente el número de entradas repetidas en cualquier brazo que nunca haya contenido una plataforma de la hoja de registro de datos. Estos son errores incorrectos de la memoria de trabajo.
- Registre la latencia para llegar a la plataforma para cada prueba.
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Resultados
Los datos de muestra de nuestro laboratorio muestran significativamente más errores incorrectos de memoria de trabajo en animales HI en comparación con los controles simulados al día once del ensayo (t = 2.124, p<0.05, (véase Figura 3A)). Los animales HI también mostraron significativamente más errores de memoria de referencia en comparación con los sujetos controles simulados al undécimo día del ensayo (t = 2.303, p<0.05, (véase Figura 3B)). Los errores incorrectos de memoria de t...
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Discusión
El paradigma del laberinto de agua radial de ocho brazos se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio y por otros para evaluar el rendimiento de la memoria de trabajo y de referencia en ratas con y sin lesión cerebral neonatal5-7,18-20. En el paradigma actual, la eliminación de una plataforma de escape después de cada prueba aumenta la demanda de memoria de trabajo (los sujetos tienen menos opciones de escape) en las pruebas posteriores. Por lo tanto, en la prueba cuatro, solo queda una plataforma y la dem...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a William Martin y al departamento de arte del Rhode Island College por su ayuda en la fabricación de laberintos. También nos gustaría agradecer a los estudiantes de Rhode Island College, Katrina Feyerherm, Molly La Rue y Nick Lafond por su trabajo en el laberinto acuático de ocho brazos. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Red de Ideas de Rhode Island para la excelencia en la investigación biomédica (RIINBRE) y el Centro Nacional de Recursos de Investigación de los NIH (Subvención # P20 RR16457-12). El Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver de los Institutos Nacionales de Salud también brindó apoyo bajo el Premio Número R15HD077544.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tina de plástico | Gototanks http://www.gototanks.com | ARM-19455 | El tamaño puede variar según la especie probada o las necesidades individuales del laboratorio. |
| iPad u otra tableta digital | Apple Inc. | N/A | http://www.apple.com |
| Notability u otra aplicación de toma de notas | Gingerlabs | N/A | http://www.gingerlabs.com Escritor digital de pdf o programa de toma de notas |
| Temporizador digital | Cualquier | N/A | |
| Almohadilla térmica isotérmica Deltaphase | Braintree Scientific | ASS7D | http://www.braintreesci.com/ |
| Inoxidable laberinto de acero | fabricado en casa | N/A |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
