Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.
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Artículo de método
Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
Los celulosomas son complejos multienzimáticos discretos utilizados por un subconjunto de bacterias y hongos anaerobios para digerir sustratos lignocelulósicos. El ensamblaje de las enzimas en la proteína del andamio no catalítico está dirigido por interacciones entre una familia de pares receptor-ligando relacionados que comprenden módulos de cohesina y dockerin que interactúan. La unión extremadamente fuerte entre los módulos de cohesina y dockerin da como resultado constantes de disociación en el rango bajo de picomolares a nanomolares, lo que puede dificultar las mediciones precisas de la tasa de apagado con los métodos convencionales a granel. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula (SMFS) con el microscopio de fuerza atómica mide la respuesta de las biomoléculas individuales a la fuerza y, a diferencia de otros métodos de manipulación de una sola molécula (es decir, pinzas ópticas), es óptima para estudiar las interacciones receptor-ligando de alta afinidad debido a su capacidad para sondear el régimen de alta fuerza (>120 pN). Aquí presentamos nuestro protocolo completo para el estudio de ensamblajes de proteínas celulosómicas a nivel de molécula única. Utilizando una topología de proteínas derivada del celulosoma nativo, trabajamos con proteínas de fusión de enzima-dockerina y módulo de unión a carbohidratos-cohesina (CBM-cohesina), cada una con un grupo tiol libre accesible en un residuo de cisteína diseñado. Presentamos nuestro protocolo de inmovilización de superficie específico del sitio, junto con nuestro procedimiento de medición y análisis de datos para obtener parámetros de unión detallados para el complejo de alta afinidad. Demostramos cómo cuantificar las fuerzas de despliegue de un solo subdominio, las fuerzas de ruptura complejas, las tasas de desconexión cinética y los anchos potenciales del pozo de unión. Se describe con mayor detalle la aplicación exitosa de estos métodos en la caracterización de la interacción cohesina-dockerina responsable del ensamblaje de complejos celulolíticos multidominio.
Introducción
Los celulosomas son grandes complejos multienzimáticos que se muestran en la superficie de las bacterias celulolíticas anaeróbicas (por ejemplo, C. thermocellum) que han evolucionado para despolimerizar eficientemente la lignocelulosa de la pared celular de la planta en oligosacáridos solubles1. Un atributo central de los celulosomas es la interacción cohesina-dockerina de alta afinidad. En el paradigma más destacado, un módulo dockerin de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado se muestra en el extremo C-terminal de las diversas enzimas bacterianas. El módulo de dockerin dirige el ensamblaje de combinaciones sinérgicas de enzimas en....
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Protocolo
Se muestra un esquema de la geometría de tracción utilizada en este trabajo para analizar la interacción cohesina-dockerina en la Figura 1A. El protocolo de inmovilización de proteínas descrito aquí para la funcionalización del cantiléver y el cubreobjetos es una versión modificada del procedimiento publicado anteriormente27. Las proteínas se expresaron a partir de vectores plasmídicos en E. coli utilizando métodos convencionales. Las proteínas se diseñaron con un grupo tiol accesible al solvente, que se utilizó en combinación con la química de maleimida para anclar la proteína mediante un enlace tioéter estable a la superficie del....
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Resultados
Utilizamos el procedimiento descrito para investigar un par cohesina-dockerina de tipo I de C. thermocellum. Tras la unión exitosa del par cohesina-dockerina, los trazos registrados de fuerza-distancia mostraron patrones de picos característicos. Un trazo típico se muestra en la Figura 4a. Cada pico en el trazo representa el desdoblamiento de un subdominio proteico, siendo el último pico correspondiente a la disociación del complejo receptor-ligando.
Para el complejo .......
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Discusión
Para obtener datos significativos de los experimentos de espectroscopia de fuerza de una sola molécula, es crucial lograr geometrías de tracción bien definidas y reproducibles. El protocolo utilizado aquí da como resultado la inmovilización específica del sitio de complejos de proteínas en una geometría de tracción definida.
Los voladizos utilizados en este estudio fueron elegidos debido a su sensibilidad a la fuerza y alta frecuencia de resonancia en el agua. Además, la pequeña curvatura de l.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores agradecen la financiación de una subvención avanzada del Consejo Europeo de Investigación a Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece la financiación de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programa. Los autores agradecen a Edward A. Bayer, Yoav Barak y Daniel B. Fried del Instituto Weizmann de Ciencias por proporcionar generosamente las proteínas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner y Stefan W. Stahl por sus útiles discusiones.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-aminopropil dimetil etoxisilano | ABCR GmbH | AB110423 | |
| 5 kDa NHS-PEG-maleimida | Rapp Polymer | 13 5000-65-35 | |
| TCEP Gel reductor de disulfuro | Thermo Scientific, Pierce | 77712 | www.thermoscientific.com/pierce |
| Tris(hidroximetil)aminometano | |||
| Mini voladizos de nitruro de silicio BioLever | Olympus | BL-AC40TS-C2 | Lotes blandos |
| XYZ Actuadores piezoeléctricos | Physik Instrumente GmbH | ||
| Infrarrojos " amplio espectro" Láser IR | Superlum | ||
| MFP-3D Controlador AFM | Asylum Research | ||
| Igor Pro 6.31 | Wavemetrics | Adquisición y análisis | |
| de datos Cloruro de | |||
| Cloruro de calcio | |||
| pH | |||
| Borato | |||
| Pinzas | |||
| Cubreobjetos | Thermo Scientific, Menzel-Glä ser | 24 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor | |
| Portamuestras | hecho a medida | ||
| Baño de sonicador Pureza | |||
| analítica | etanol | ||
| Ácido sulfúrico (concentrado) | pureza analítica | ||
| Peróxido de hidrógeno (30%) | pureza analítica | ||
| Agitador orbital | |||
| Pureza analítica | del tolueno | ||
| Papel | |||
| Portaobjetos de vidrio Microtubos | |||
| Micropipetas | |||
| Centrífuga | adecuada para microtubos | ||
| Rotador | |||
| de Petri | |||
| Vaso de precipitados | |||
| Microscopio |
Referencias
- Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
- Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. ....
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Reimpresiones y permisos
