Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

Markus A. Jobst; Constantin Schoeler; Klara Malinowska; Michael A. Nash

doi:10.3791/50950

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Artículo de método

Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

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DOI:

10.3791/50950

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20 de diciembre de 2013

Markus A. Jobst^*¹ , Constantin Schoeler^*¹ , Klara Malinowska¹ , Michael A. Nash¹

¹Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.

Resumen

Los celulosomas son complejos multienzimáticos discretos utilizados por un subconjunto de bacterias y hongos anaerobios para digerir sustratos lignocelulósicos. El ensamblaje de las enzimas en la proteína del andamio no catalítico está dirigido por interacciones entre una familia de pares receptor-ligando relacionados que comprenden módulos de cohesina y dockerin que interactúan. La unión extremadamente fuerte entre los módulos de cohesina y dockerin da como resultado constantes de disociación en el rango bajo de picomolares a nanomolares, lo que puede dificultar las mediciones precisas de la tasa de apagado con los métodos convencionales a granel. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula (SMFS) con el microscopio de fuerza atómica mide la respuesta de las biomoléculas individuales a la fuerza y, a diferencia de otros métodos de manipulación de una sola molécula (es decir, pinzas ópticas), es óptima para estudiar las interacciones receptor-ligando de alta afinidad debido a su capacidad para sondear el régimen de alta fuerza (>120 pN). Aquí presentamos nuestro protocolo completo para el estudio de ensamblajes de proteínas celulosómicas a nivel de molécula única. Utilizando una topología de proteínas derivada del celulosoma nativo, trabajamos con proteínas de fusión de enzima-dockerina y módulo de unión a carbohidratos-cohesina (CBM-cohesina), cada una con un grupo tiol libre accesible en un residuo de cisteína diseñado. Presentamos nuestro protocolo de inmovilización de superficie específico del sitio, junto con nuestro procedimiento de medición y análisis de datos para obtener parámetros de unión detallados para el complejo de alta afinidad. Demostramos cómo cuantificar las fuerzas de despliegue de un solo subdominio, las fuerzas de ruptura complejas, las tasas de desconexión cinética y los anchos potenciales del pozo de unión. Se describe con mayor detalle la aplicación exitosa de estos métodos en la caracterización de la interacción cohesina-dockerina responsable del ensamblaje de complejos celulolíticos multidominio.

Introducción

Los celulosomas son grandes complejos multienzimáticos que se muestran en la superficie de las bacterias celulolíticas anaeróbicas (por ejemplo, C. thermocellum) que han evolucionado para despolimerizar eficientemente la lignocelulosa de la pared celular de la planta en oligosacáridos solubles¹. Un atributo central de los celulosomas es la interacción cohesina-dockerina de alta afinidad. En el paradigma más destacado, un módulo dockerin de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado se muestra en el extremo C-terminal de las diversas enzimas bacterianas. El módulo de dockerin dirige el ensamblaje de combinaciones sinérgicas de enzimas en la proteína de andamio no catalítica ('scaffoldin'), que comprende una poliproteína de dominios de cohesina que son específicos para el módulo de dockerin de tipo I. A niveles superiores, la arquitectura del celulosoma puede llegar a ser muy compleja, incorporando pares alternativos de cohesinas y dockerinas (por ejemplo, tipo II, tipo III) que anclan las estructuras a la superficie de la célula y permiten el ensamblaje de estructuras ramificadas que contienen múltiples andamios². Los diversos tipos de cohesina-dockerina, a pesar de tener estructuras relacionadas, exhiben especificidades de unión diferencial que suprimen la reactividad cruzada con andamios no deseados o componentes de otras especies bacterianas productoras de celulosoma. Si bien los enfoques bioinformáticos han identificado con éxito miles de componentes celulosómicos únicos a nivel genético, se conocen comparativamente pocas estructuras de proteínas, y los mecanismos que operan en la determinación de la especificidad de la cohesina-dockerina siguen siendo un área activa de la investigación en biología estructural.

Desde la invención del microscopio de fuerza atómica (AFM) por Binnig et al.³, se han desarrollado y mejorado continuamente varios modos operativos de AFM, incluidas las imágenes sin contacto, las imágenes en modo de oscilación⁴ y la espectroscopia de fuerza de molécula única (SMFS)^5,6. SMFS se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para sondear directamente las proteínas^{individuales 7-11}, los ácidos nucleicos^12-15 y los polímeros sintéticos^16-19. En un experimento típico de SMFS para investigar la unión receptor-ligando^20,21, una punta en voladizo de AFM se modifica con uno de los socios de unión, mientras que una superficie de vidrio plana se modifica con el socio de unión complementario. El voladizo modificado se pone en contacto con la superficie, lo que permite que los socios se unan. A continuación, la base del voladizo se retira a velocidad constante y la fuerza se mide mediante el método óptico de deflexión de la palanca. Las trazas de datos de fuerza-distancia resultantes exhiben picos en forma de diente de sierra si se estableció la unión. En los casos en los que los socios de unión están fusionados a múltiples dominios de proteína, cada pico en la traza de fuerza-distancia se puede correlacionar con el despliegue de un solo dominio de proteína o subdominio plegado, mientras que el último pico corresponde a la ruptura de la interfaz de unión a proteínas. Las posiciones específicas de los elementos resistentes a la fuerza se pueden utilizar como huella dactilar para identificar los diversos dominios proteicos de interés. Este método se puede utilizar para interrogar aminoácidos importantes involucrados en el plegamiento y estabilización de proteínas. Se han reportado muchos modelos en la literatura para tratar el comportamiento característico de extensión de fuerza observado en experimentos SMFS. Los modelos más utilizados incluyen la cadena de unión libre (FJC) modelo²², la cadena en forma de tornillo sin fin (WLC) modelo^18,23-25 y la cadena de rotación libre (FRC) modelo^25,26.

En nuestro trabajo anterior¹¹, utilizamos espectroscopía de fuerza de una sola molécula para investigar la interacción de los módulos de cohesina y dockerin. Aquí, presentamos un protocolo experimental para la funcionalización de la superficie del vidrio y el voladizo con construcciones de proteínas enzimática-dockerina y CBM-cohesina. También presentamos un protocolo SMFS basado en AFM que incluye procedimientos de adquisición y análisis de datos. El protocolo descrito puede generalizarse fácilmente a otros sistemas moleculares, y debería resultar particularmente útil para los investigadores interesados en pares de ligandos de receptores de alta afinidad.

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Protocolo

Se muestra un esquema de la geometría de tracción utilizada en este trabajo para analizar la interacción cohesina-dockerina en la Figura 1A. El protocolo de inmovilización de proteínas descrito aquí para la funcionalización del cantiléver y el cubreobjetos es una versión modificada del procedimiento publicado anteriormente²⁷. Las proteínas se expresaron a partir de vectores plasmídicos en E. coli utilizando métodos convencionales. Las proteínas se diseñaron con un grupo tiol accesible al solvente, que se utilizó en combinación con la química de maleimida para anclar la proteína mediante un enlace tioéter estable a la superficie del cubreobjetos y al cantiléver. Los residuos de cisteína modificados en las proteínas de fusión CBM-cohesina y xilanasa-dockerina se ubicaron hacia el extremo N-terminal de las proteínas, lejos de la interfaz de unión entre cohesina y dockerina¹¹. Se muestra un resumen detallado de los enlaces químicos empleados en la inmovilización de proteínas en la Figura 1B.

1. Preparación de la muestra

Tampones
1. Preparar tampón salino tamponado con Tris suplementado con calcio (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7.2
2. Preparar tampón de borato sódico: 50 mM Na₂B₄O₇, pH 8.5
  El diagrama de flujo del proceso que muestra los pasos de preparación de la muestra se muestra en la Figura 2.
  Al manipular las palancas y las cubreobjetos, se recomienda el uso de pinzas autocerrables.
Aminosilanización del cubreobjetos (aproximadamente 1,5 h)
1. Colocar el cubreobjetos (diámetro de 24 mm, espesor de 0,5 mm) en un soporte de PTFE.
2. Someta el cubreobjetos a sonicación en una mezcla 1:1 de etanol : agua ultrapura (v/v) durante 15 min.
3. Lavar el cubreobjetos con agua ultrapura.
4. Colocar el cubreobjetos en solución piraña (1:1 H₂SO₄ (concentrado) : H₂O₂ (30%) (v/v)) durante 30 min, luego enjuagar abundantemente con agua ultrapura. Secar el cubreobjetos bajo una corriente suave de N₂. Precaución: la solución piraña es extremadamente corrosiva. Se requiere protección ocular y de la piel.
5. Sumergir el cubreobjetos en una mezcla 45:5:1 de etanol : agua ultrapura : 3-aminopropil dimetil etoxisilano (v/v). Colocar sobre un agitador a temperatura ambiente (RT) durante 60 min (aproximadamente 50 rpm).
6. Sumergir el cubreobjetos secuencialmente en etanol y agua ultrapura (2 veces cada uno). Secar el cubreobjetos bajo una corriente suave de N₂.
7. Calentar el cubreobjetos en una estufa (80 °C durante 30 min).
8. Los cubreobjetos silanizados pueden almacenarse bajo argón hasta por 6 semanas.
Aminosilanización de las palancas (aproximadamente 1,5 h)
NOTA: El protocolo presentado para la funcionalización de puntas es adecuado para puntas de palancas de silicio.
1. Colocar las palancas sobre una lámina de vidrio limpia. Tratar con ozono-UV durante 15 min.
2. Sumergir las palancas durante 3 min en una mezcla 1:1 de etanol : 3-aminopropil dimetil etoxisilano (v/v) con una cantidad catalítica (0,25%, v/v) de agua ultrapura.
3. Enjuagar las palancas con agitación suave secuencialmente durante 60 s en vasos de precipitados con tolueno, etanol y agua ultrapura. Secar cuidadosamente las palancas sobre papel de filtro entre cada enjuague.
4. Colocar las palancas sobre una lámina de vidrio limpia y calentar (80 °C durante 30 min).
Reducción de disulfuros proteicos (aproximadamente 3 h)
Todas las soluciones deben prepararse para obtener aproximadamente 30 µl de proteína diluida por palanca y 20 µl de proteína diluida por cubreobjetos. Las soluciones de proteína deben mezclarse con el gel reductor de disulfuros Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en una proporción de 1:2 (v/v).
1. Preparar alícuotas de perlas reductoras de disulfuros TCEP en microtubos. Se recomienda cortar las puntas de micropipeta con tijeras para ampliar el diámetro del orificio al pipetear la suspensión de perlas de TCEP.
2. Lavar la suspensión de perlas de TCEP con 1 ml de tampón TBS y centrifugar a 850 rcf durante 3 min.
3. Eliminar cuidadosamente y desechar el sobrenadante con una micropipeta.
4. Repetir los pasos 1.4.2-1.4.3 dos veces.
5. Añadir la solución concentrada de proteína (1-10 mg/ml) a las perlas de TCEP (1:2 proteína : suspensión de perlas de TCEP (v/v)) y mezclar suavemente agitando con la punta de la micropipeta. Evitar la introducción de burbujas de aire.
6. Colocar la mezcla de suspensión de proteína/perlas de TCEP en un rotador durante 2,5 h.
PEGilación de cubreobjetos y palancas (aproximadamente 1,5 h)
1. Antes de la modificación con enlazadores NHS-PEG-maleimida, sumergir las palancas y cubreobjetos aminosilanizados en tampón de borato sódico (pH 8,5) durante 45 min para desprotonar los grupos amina primarios en la superficie.
2. Asegurarse de que el polvo de NHS-PEG-maleimida alcance la temperatura ambiente antes de abrir el tapón y pesar la cantidad adecuada para una solución 25 mM. El NHS-PEG-maleimida no utilizado debe almacenarse bajo argón a -20 °C. Se requiere aproximadamente 30 µl de solución polimérica por palanca y 90 µl por cada par de cubreobjetos (colocados en sandwich).
3. Después de pesar el NHS-PEG-maleimida de 5 kDa, añadir tampón de borato sódico y vortexiar para obtener una solución 25 mM.
  Nota: La solución debe usarse lo más rápidamente posible debido a la vida media extremadamente corta del NHS a pH 8,5. La vortexiación y la transferencia del líquido a las palancas/cubreobjetos deben completarse en 1-2 min.
4. Incubar las palancas en gotas de 30 µl de solución de NHS-PEG-maleimida en una placa de Petri. Para los cubreobjetos, colocar 90 µl de solución de NHS-PEG-maleimida sobre un cubreobjetos individual y colocar un segundo cubreobjetos encima, formando un sandwich con la solución de NHS-PEG-maleimida en el medio.
5. Incubar las palancas/cubreobjetos con la solución de NHS-PEG-maleimida en una atmósfera saturada con agua a temperatura ambiente durante 1 h.
Conjugación de proteínas (aproximadamente 2 h)
Crucial: Minimizar la exposición de las palancas y cubreobjetos PEGilados al aire.
1. Centrifugar las soluciones de proteína reducida/perlas de TCEP a 100 rcf durante 1 min y recoger el sobrenadante.
2. Diluir la solución de proteína con TBS. Busque una concentración de proteína durante la conjugación superficial en un rango de 0,5-2 mg/ml. Dejar las soluciones de proteína reducida y diluida aparte durante unos minutos mientras se enjuagan las palancas y los cubreobjetos.
3. Enjuagar las palancas y los cubreobjetos en tres vasos de precipitados consecutivos con agua ultrapura.
4. Eliminar cuidadosamente el líquido residual de los cubreobjetos tocando suavemente los bordes con papel de filtro bajo una corriente suave de N₂. Eliminar cuidadosamente el líquido residual de las palancas tocándolas con papel de filtro. Aplicar inmediatamente la solución de proteína diluida.
5. Montar los cubreobjetos en un portamuestras adecuado compatible con el instrumento de AFM.
6. Incubar los cubreobjetos y palancas PEGilados con sus respectivas soluciones de proteína diluida a temperatura ambiente durante 1-2 h.
7. Enjuagar las palancas en tres vasos de precipitados consecutivos con TBS para eliminar proteínas no unidas. Pipetear y enjuagar los cubreobjetos al menos 10 veces.
8. Almacenar las palancas y los cubreobjetos bajo TBS antes de la medición.

2. Adquisición de datos

En este trabajo, se utilizó un microscopio de fuerza atómica (AFM) de construcción personalizada²⁸, controlado por un controlador MFP-3D de Asylum Research con un software personalizado escrito en Igor Pro. La deflexión del cantiléver se mide mediante el método de deflexión del haz óptico²⁹. Los protocolos de preparación de muestras y análisis de datos proporcionados aquí son aplicables independientemente del modelo exacto de AFM utilizado. Sin embargo, el modelo de AFM debe ser adecuado para realizar mediciones en líquidos y debe permitir un rango de velocidad accesible en el piezoeléctrico z de aproximadamente 200-5.000 nm/seg.

Monte el cantiléver funcionalizado y la superficie de vidrio en el microscopio de fuerza atómica (AFM). Durante todo el procedimiento, la superficie debe permanecer cubierta con tampón. Al montar el cantiléver, minimice la exposición al aire. Tras ajustar correctamente el haz láser, deje que el sistema alcance el equilibrio durante al menos 30 minutos para reducir cualquier efecto de deriva y realice ajustes si es necesario.
Registre un espectro de ruido térmico con el cantiléver alejado de la superficie, es decir, en ausencia de efectos de amortiguación.
Utilice un método mínimamente invasivo, como el enfoque acústico, para localizar la superficie sin dañar previamente la punta del cantiléver antes de la medición. Si es posible, acerque manualmente el cantiléver hacia la superficie y use auriculares para escuchar el ruido térmico en la salida de deflexión cruda del controlador del AFM. Tan pronto como el cantiléver se acerque a la superficie, será audible un cambio claro en el sonido.
Nota: La punta del cantiléver ahora debería estar a una distancia de 2-5 µm de la superficie. La naturaleza del cambio de sonido depende del cantiléver utilizado. La frecuencia de resonancia del cantiléver usado en este trabajo es aproximadamente 25 kHz en agua, por encima del rango audible humano. Debido a los efectos de amortiguación cerca de la superficie, la resonancia se desplaza hacia frecuencias más bajas, introduciendo la resonancia del cantiléver dentro del rango audible. Por lo tanto, se percibe un aumento aparente en la frecuencia y en la intensidad del sonido.
En casos donde no se disponga de una salida de audio de la señal de deflexión, se puede acercar la superficie mediante el z-piezoelectricidad mientras se mantiene activo un lazo de retroalimentación sobre la señal de deflexión. Tan pronto como la señal de deflexión aumente en una cantidad definida debido a la indentación de la superficie, se detiene el acercamiento.
Determine la sensibilidad inversa del palanca óptica (InvOLS), que representa la distancia de desplazamiento de la punta (en nm) por voltio de señal de deflexión. Haga esto indentando la superficie con la punta del cantiléver. Se recomienda un voltaje de punto de ajuste de deflexión correspondiente a un desplazamiento de la punta del cantiléver de aproximadamente 3 nm.
Determine la constante elástica del cantiléver ajustando una función de respuesta de oscilador armónico simple al espectro de ruido térmico, de acuerdo con el teorema de equipartición^30,31.
Inicie una rutina experimental. Para este trabajo, se utilizó el siguiente conjunto de parámetros de medición: velocidad de acercamiento: 3.000 nm/seg; fuerza de indentación: 180 pN; tiempo de permanencia en la superficie: 10 mseg; velocidades de retracción: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/seg con tasas de muestreo de 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz respectivamente; distancia de retracción: 500 nm.
Nota: La tasa de muestreo no debe establecerse superior a 10 puntos/nm para evitar el sobremuestreo y mantener tamaños de datos razonables.
Después de cada traza fuerza-distancia, accione los estadios piezoeléctricos x e y para exponer una nueva ubicación de la superficie al cantiléver en cada curva fuerza-distancia. Esta técnica permite muestrear un área mayor de la superficie del cubreobjetos durante mediciones a largo plazo.
Utilice reajustes periódicos a cero de la etapa de deflexión (es decir, posición del fotodiodo) y de la altura del chasis z-piezoelectricidad durante mediciones prolongadas, en caso de que la señal de deflexión se desvíe fuera del rango o se pierda el contacto con la superficie.
Al finalizar la serie de mediciones, realice otra medición de InvOLS con una fuerza de indentación significativamente mayor que la utilizada antes de las mediciones, para obtener un valor de InvOLS más preciso.
Registre otro espectro de ruido térmico lejos de la superficie. Determine la constante elástica al final de la serie experimental.

3. Análisis de datos

El diagrama de flujo de la Figura 3 ilustra el proceso de análisis de datos. Realice todas las manipulaciones de datos utilizando un paquete de software adecuado, como Igor Pro o MATLAB. Primero, convierta la señal cruda del detector en unidades de fuerza y corrija el desplazamiento y la deriva. Posteriormente, utilice modelos de elasticidad de biopolímeros para localizar barreras de energía en las vías de desnaturalización e identificar subdominios proteicos. Finalmente, se obtienen los parámetros cinéticos y energéticos de la interacción receptor-ligando.

Conversión de unidades y correcciones de datos
1. Multiplicar la señal de desviación cruda (voltios) por el InvOLS (nm/voltio) y la constante del resorte (pN/nm) para convertir el voltaje del detector en unidades de fuerza.
2. Desplazar los datos de manera que la fuerza en el cantiléver sin carga sea de cero pN, promediando primero los valores de fuerza del último 10 % del trazado fuerza-distancia (adquirido más lejos de la superficie) y luego restando este promedio de todos los valores de fuerza en el trazado de datos.
3. Desplazar cada trazado en la dirección x de forma que la primera intersección con el eje de distancia ocurra a una distancia de 0 nm.
4. El InvOLS depende de la posición del punto láser sobre el cantiléver. Incluso pequeñas cantidades de deriva en el sistema de lectura óptica pueden provocar cambios notables en el InvOLS cuando el tamaño del cantiléver es comparable al tamaño del punto láser. Corregir esto mediante el análisis del ruido en la señal de desviación a fuerza cero. Suponiendo condiciones ambientales constantes, el ruido en la señal de desviación es directamente proporcional al InvOLS.
  1. Medir el valor cuadrático medio (RMS) de la desviación (nivel de ruido bajo fuerza cero) del último 10 % de cada trazado fuerza-distancia.
  2. Representar gráficamente el ruido frente al número de curva y aplicar un ajuste adecuado. Normalmente, un ajuste exponencial de la forma funcionará mejor, donde N es el ruido, ni es el número de curva, y N0 y k son parámetros de ajuste. Un ajuste lineal también puede ser apropiado para ciertos conjuntos de datos.
  3. Determinar un factor de escala (SF) para cada curva:
    
    Ecuación 1:
    
    donde ni es el número de curva, nf es el número de la curva final, y C es un desplazamiento.
  4. A continuación, dividir todos los valores de fuerza en cada curva individual por el factor de escala. Este procedimiento escala cada curva por la relación entre el valor RMS del ruido de la curva actual y el valor RMS del ruido de la curva final adquirida inmediatamente antes de la medición del InvOLS.
  5. Realizar una corrección de desviación para transformar el eje de distancia (z) en extensión molecular (z*). Esto tiene en cuenta la flexión del cantiléver bajo fuerza, que acorta la distancia entre la punta del cantiléver y la muestra respecto al valor reportado por la posición del sensor z-piezo.
    
    Ecuación 2:
    
    Dónde z es la posición medida del sensor z, F la fuerza que actúa sobre el cantiléver y k la constante del resorte.
Análisis de longitud de contorno
La longitud de contorno de una proteína es la longitud máxima estirada de la cadena polipeptídica. El estado de plegamiento de una proteína se refiere a su geometría y distancia extremo a extremo determinada por la estructura secundaria y terciaria. La longitud de contorno de una proteína está directamente relacionada con su estado de plegamiento^9,25,32. La posición de rupturas específicas en los trazados fuerza-extensión varía ampliamente debido a la polidispersidad de los enlazadores PEG, así como a parámetros externos como la temperatura, las propiedades del tampón y las tasas de carga. Esto complica el análisis directo de los datos, pero puede superarse transformando los datos fuerza-extensión al espacio de longitud de contorno. Esta técnica permite promediar grandes conjuntos de datos y permite el uso de reconocimiento automático de patrones para identificar eventos característicos de desnaturalización. Por lo tanto, es posible clasificar trazados de fuerza individuales según el tipo de interacción exhibida. El siguiente procedimiento descrito previamente²⁵ se utiliza para transformar los datos fuerza-extensión al espacio de longitud de contorno.
1. Resolver el modelo WLC (Ecuación 3)²³ para la longitud de contorno L a una longitud de persistencia fija p da como resultado la Ecuación 4, que proporciona la longitud de contorno L(x,u). Aquí, x es la distancia y u=F*p/kBT, donde kB es la constante de Boltzmann y T es la temperatura. Solo pueden considerarse soluciones reales. Las restricciones adicionales son x, F>0, L>0, x>0;
  
  Ecuación 3:
  
  Ecuación 4:
  
  dónde,
  $Ecuación de función polinómica $ g(u) $, análisis matemático, cálculo simbólico.$

Análisis de tasa de carga
Extraer información cinética y energética sobre la disociación receptor-ligando aplicando modelos adecuados al espectro de fuerza, es decir, el gráfico de fuerza de ruptura frente a ln(tasa de carga).

Para una velocidad de tracción dada, determinar la fuerza de ruptura y la tasa de carga para los eventos de ruptura de interés:

Realizar un ajuste lineal a un trazado fuerza-tiempo en las proximidades del evento de ruptura de interés. Determinar la tasa de carga a partir de la pendiente del ajuste lineal en el pico. Repetir este procedimiento para cada trazado que muestre el evento de ruptura de interés.

Determinar la fuerza de ruptura más probable aplicando un ajuste gaussiano a un histograma de las fuerzas de ruptura. Es posible utilizar funciones de ajuste alternativas.

Determinar la tasa de carga más probable.

Repetir los pasos 3.3.3.1 - 3.3.3.3 para todas las velocidades de tracción.

Representar gráficamente las fuerzas de ruptura más probables frente al logaritmo natural de las tasas de carga más probables para obtener el espectro de fuerza.

Aplicar un modelo teórico adecuado al espectro de fuerza para extraer parámetros cinéticos y energéticos (Figura 4C). En muchos casos, puede utilizarse el modelo lineal de Bell-Evans^20,34, que proporcionará buenas estimaciones de koff, la tasa de disociación en ausencia de fuerza, y Dx, la distancia al estado de transición a lo largo de la coordenada de reacción, como se muestra en la Ecuación 5.

Ecuación 5:

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Resultados

Utilizamos el procedimiento descrito para investigar un par cohesina-dockerina de tipo I de C. thermocellum. Tras la unión exitosa del par cohesina-dockerina, los trazos registrados de fuerza-distancia mostraron patrones de picos característicos. Un trazo típico se muestra en la Figura 4a. Cada pico en el trazo representa el desdoblamiento de un subdominio proteico, siendo el último pico correspondiente a la disociación del complejo receptor-ligando.

Para el complejo ...

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Discusión

Para obtener datos significativos de los experimentos de espectroscopia de fuerza de una sola molécula, es crucial lograr geometrías de tracción bien definidas y reproducibles. El protocolo utilizado aquí da como resultado la inmovilización específica del sitio de complejos de proteínas en una geometría de tracción definida.

Los voladizos utilizados en este estudio fueron elegidos debido a su sensibilidad a la fuerza y alta frecuencia de resonancia en el agua. Además, la pequeña curvatura de l...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiación de una subvención avanzada del Consejo Europeo de Investigación a Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece la financiación de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programa. Los autores agradecen a Edward A. Bayer, Yoav Barak y Daniel B. Fried del Instituto Weizmann de Ciencias por proporcionar generosamente las proteínas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner y Stefan W. Stahl por sus útiles discusiones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-aminopropil dimetil etoxisilano	ABCR GmbH	AB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimida	Rapp Polymer	13 5000-65-35
TCEP Gel reductor de disulfuro	Thermo Scientific, Pierce	77712	www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hidroximetil)aminometano
Mini voladizos de nitruro de silicio BioLever	Olympus	BL-AC40TS-C2	Lotes blandos
XYZ Actuadores piezoeléctricos	Physik Instrumente GmbH
Infrarrojos " amplio espectro" Láser IR	Superlum
MFP-3D Controlador AFM	Asylum Research
Igor Pro 6.31	Wavemetrics		Adquisición y análisis
de datos Cloruro de
Cloruro de calcio
			pH
Borato
Pinzas
Cubreobjetos	Thermo Scientific, Menzel-Glä ser		24 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor
Portamuestras			hecho a medida
Baño de sonicador Pureza
analítica	etanol
Ácido sulfúrico (concentrado)			pureza analítica
Peróxido de hidrógeno (30%)			pureza analítica
Agitador orbital
Pureza analítica	del tolueno
Papel
Portaobjetos de vidrio Microtubos
Micropipetas

Centrífuga			adecuada para microtubos
Rotador
			de Petri
Vaso de precipitados
Microscopio

sodio Medidor de de sodio de PTFE dede filtroPlacas óptico

Referencias

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