Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

Summary

Se describe la generación de quimeras de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa para el estudio del origen de las células estromales de los ganglios linfáticos. El método implica el aislamiento de ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y almohadillas de grasa embrionaria, la generación de almohadillas quiméricas de grasa de ganglios linfáticos y su transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped.

Abstract

El estroma es un componente clave de la estructura y función de los ganglios linfáticos. Sin embargo, se sabe poco sobre su origen, composición celular exacta y los mecanismos que rigen su formación. Los ganglios linfáticos siempre están encapsulados en el tejido adiposo y recientemente hemos demostrado la importancia de esta relación para la formación del estroma ganglionar. Las células precursoras de los adipocitos migran al ganglio linfático durante su desarrollo y, al unirse al receptor de linfotoxina-b, desactivan la adipogénesis y se diferencian en células estromales linfoides (Bénézech et al.¹⁴). Con base en el potencial del estroma linfoide del tejido adiposo, presentamos un método que utiliza una quimera de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa que permite el rastreo del linaje de los precursores de células estromales de los ganglios linfáticos. Mostramos cómo aislar los ganglios linfáticos recién nacidos y el tejido adiposo embrionario EYFP⁺ y hacer una quimera de almohadilla de grasa LN/EYFP⁺. Después de la transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped, el ganglio linfático incorpora células precursoras de tejido adiposo local y termina su formación. El análisis de la progenie de las células de la almohadilla grasa EYFP⁺ en los ganglios linfáticos resultantes se puede realizar mediante el análisis de citometría de flujo de los ganglios linfáticos digeridos enzimáticamente o mediante el análisis de inmunofluorescencia de las criosecciones de los ganglios linfáticos. Mediante el uso de almohadillas de grasa de diferentes modelos de ratones knockout, este método proporcionará una forma eficiente de analizar el origen de las diferentes poblaciones de células estromales de los ganglios linfáticos.

Introduction

Los ganglios linfáticos (LNs) son órganos clave del sistema inmune situados en sitios estratégicos del cuerpo, a lo largo de la red de vasculatura linfática. Permiten la filtración de antígenos y patógenos y proporcionan un sitio para la presentación de antígenos a los linfocitos y la inducción de respuestas inmunitarias adaptativas. El estroma, que forma la estructura básica de la LN y orquesta el movimiento de los diferentes participantes hematopoyéticos de la respuesta inmunitaria adaptativa, es fundamental para la función de estos órganos. Diferentes poblaciones de células estromales suministran señales esenciales y específicas para los movimientos, localización, supervivencia, proliferación y maduración del componente hematopoyético del sistema inmune^1-3. Las células estromales LN adultas se dividen en tres categorías: las células endoteliales sanguíneas, las células endoteliales linfáticas y los fibroblastos. Estas tres categorías engloban poblaciones heterogéneas. Las poblaciones fibroblásticas contienen células reticulares fibroblásticas (FRC), células dendríticas foliculares (FDC), células reticulares marginales (MRC), mientras que los fibroblastos forman la cápsula, la médula y otras células aún no identificadas^1-5. Los orígenes y los mecanismos que gobiernan la maduración de las diferentes poblaciones de células estromales LN no están claros, y la ausencia de marcadores específicos que permitan el mapeo del destino de poblaciones específicas de células estromales LN hace que su estudio sea particularmente difícil. Sin embargo, es necesario una comprensión completa de la ontogenia de las células estromales LN para la comprensión de las respuestas inmunitarias adaptativas, los mecanismos que contribuyen a la tolerancia y está en la base del desarrollo de LN artificiales.

Hasta ahora, el estudio del origen y desarrollo de las células estromales LN se ha limitado principalmente a la evaluación directa del desarrollo de LN en embriones y recién nacidos en ratones de tipo salvaje y diferentes cepas de ratones knockout^6-9. Estos enfoques están limitados por la letalidad embrionaria y perinatal de algunas de las cepas de ratones portadoras de deleciones en genes importantes para el desarrollo de la LN. Además, algunos de los genes esenciales para el desarrollo del tejido linfoide también están implicados en una amplia gama de procesos biológicos, como es el caso de RANK^10-11 o NF-κB2¹². Para abordar estos problemas, se ha realizado el aislamiento y trasplante de LNs embrionarios bajo la cápsula renal de un ratón huésped^12-13. Esta técnica permite, por ejemplo, la transferencia de LNs embrionarios modificados genéticamente en un entorno de tipo salvaje para evaluar el desarrollo de los órganos y el reclutamiento y organización de las células huésped. Sin embargo, el crecimiento de LN embrionario injertado debajo de la cápsula renal de un huésped adulto se ve afectado, lo que limita el uso de esta técnica.

LNs y los depósitos de grasa están anatómicamente estrechamente asociados y se desarrollan simultáneamente durante la embriogénesis. Recientemente hemos demostrado que la asociación LN/tejido adiposo desempeña un papel crucial en la provisión de progenitores de células estromales para las LN. En particular, la señalización a través de LTβR controla el destino de las células precursoras de los adipocitos al bloquear la adipogénesis y, en cambio, promover la maduración hacia un fenotipo de células estromales LN¹⁴. En este trabajo describimos un método basado en la generación de quimeras de almohadillas de grasa LN que permite el rastreo de células derivadas del tejido adiposo en el LN en desarrollo. Este método será útil para determinar la contribución de los tejidos adiposos a diferentes poblaciones de células estromales LN y, combinado con el uso de tejidos procedentes de cepas de ratón modificadas genéticamente, permitirá una mejor comprensión de los mecanismos que controlan la diferenciación de los diferentes subconjuntos de células estromales LN.

Protocol

Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones de SPF en la Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Birmingham de acuerdo con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y del comité de ética local. Todos los procedimientos descritos en este protocolo están cubiertos por una Licencia de Proyecto aprobada tanto por el comité de ética local como por el Ministerio del Interior.

1. Aislamiento de las LN recién nacidas

1. Sacrificar los ratones recién nacidos por luxación cervical.
2. Sección la cabeza y abra el cuerpo con tijeras desde la parte superior de la región torácica hasta la parte inferior de la región abdominal y retire cuidadosamente todas las vísceras (corazón, pulmones, hígado, intestino, riñón, vejiga) de la cavidad abdominal.
3. Transfiera el cuerpo a una placa de Petri de 90 mm que contenga medios RF10 (RPMI1640 medios suplementados con suero fetal bovino al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina). A partir de este paso, los tejidos se mantendrán en condiciones estériles y se manipularán en una campana de cultivo de tejidos.
4. Transfiera el cuerpo a una nueva placa de Petri de 90 mm que contenga RF10.
5. Bajo el microscopio de disección, separe cuidadosamente el peritoneo de la piel en la región inguinal. El LN inguinal está situado en la intersección de tres vasos sanguíneos en la almohadilla de grasa.
6. Retire con cuidado el LN. Asegúrese de que se haya eliminado todo el tejido adiposo. Transfiera el LN a una placa de Petri de 50 mm que contenga medios RF10. Mantenga los pañuelos en hielo mientras continúa con el procedimiento.

2. Aislamiento de almohadillas de grasa E18.5

1. Para generar embriones de ratón en el día 18.5 de gestación (E18.5), establezca embarazos cronometrados colocando una hembra y un ratón macho por jaula durante la noche. Separe los ratones por la mañana y compruebe si hay tapones vaginales (día gestacional E0,5).
   1. Eutanasia de las hembras taponadas en el día 18,5 de embarazo por luxación cervical.
   2. Extraiga los embriones y colóquelos en una placa de Petri de 90 mm que contenga RF10.
2. A partir de este paso, los tejidos deben manipularse mediante técnica estéril en la campana de cultivo de tejidos. Bajo el microscopio de disección, corte la cabeza, abra los embriones con unas tijeras desde la región torácica hasta la parte inferior de la región abdominal y retire cuidadosamente todas las vísceras (corazón, pulmones, hígado, intestino, riñón, vejiga) de la cavidad corporal.
3. Limpie el cuerpo de todos los tejidos viscerales restantes y lávelo con PBS para eliminar todos los rastros de sangre que puedan dificultar la disección.
4. Transfiera los cuerpos limpios a una placa de Petri nueva de 90 mm que contenga RF10.
5. Separe con cuidado el peritoneo de la piel en la región inguinal. El LN inguinal está situado en la intersección de tres vasos sanguíneos en la almohadilla de grasa.
6. Retire con cuidado el LN y deséchelo. Es muy importante eliminar completamente el LN para asegurarse de que la almohadilla de grasa utilizada para las quimeras no esté contaminada por ninguna célula estromal linfoide.
7. Retire la almohadilla de grasa inguinal y transfiérala a una placa de Petri de 50 mm que contenga medios RF10. Mantenga los pañuelos en hielo mientras continúa con el procedimiento.

3. Generación de la Quimera de la Almohadilla de grasa LN

1. Preparar el sistema de cultivo de órganos in vitro ¹⁵.
   1. Preparación de esponjas y filtros: Esto se puede hacer con anticipación y las esponjas y filtros se almacenan estériles en una placa de Petri en la campana de cultivo.
      1. Corta la envoltura interior de Vulkan en 1-1,5 cm² piezas
      2. Hervir las esponjas durante 2 horas en agua destilada.
      3. Deje que las esponjas se sequen durante un par de horas en la campana de cultivo celular.
      4. Hervir los filtros durante 20 min.
      5. Deje que los filtros se sequen durante un par de horas en la campana de cultivo celular.
   2. Prepare medios DMEM complementados con 10% de suero fetal bovino, 10 mM de HEPES, 1x Solución de aminoácidos no esenciales MEM, 50 mM de 2-Mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina.
   3. Añada 2 ml de medio en una placa de Petri de 50 mm.
   4. Coloca una esponja en el fondo de la placa de Petri. Humedece ambos lados de la esponja sumergiéndolos en el medio.
   5. Coloca un filtro encima de la esponja. El filtro se coloca en la interfaz líquido-aire.
2. Bajo el microscopio de disección, vuelva a asociar cuidadosamente un LN recién nacido con una almohadilla de grasa embrionaria.
3. Coloque la quimera de la almohadilla de grasa LN en la parte superior del filtro.
4. Transfiera la placa de Petri en una caja de plástico rectangular con un par de agujeros en la tapa y que contenga agua en la parte inferior para garantizar la humedad.
5. Sella la tapa de la caja con cinta adhesiva. Deja abiertos los dos agujeros de la tapa.
6. Transfiera la caja a una incubadora de cultivos celulares a 37 °C con 5% de CO₂. Deje que la caja se equilibre durante 2 horas, antes de sellar los agujeros de la tapa con cinta adhesiva.
7. Incubar los tejidos durante al menos 2 días para permitir que el LN se adhiera a la almohadilla de grasa y sea transferible debajo de la cápsula renal.

4. Transferencia de la quimera de la almohadilla de grasa LN debajo de la cápsula renal de ratones huéspedes

1. Recoja las quimeras de la almohadilla de grasa LN del filtro y transfiéralas debajo de la cápsula de riñón de los ratones huéspedes. El método de transferencia de la cápsula renal ya ha sido descrito ¹⁶.

5. Aislamiento de los LN transferidos

1. Después de 3-4 semanas bajo la cápsula de riñón, las quimeras de las almohadillas de grasa LN están listas para ser cosechadas. Eutanasia a los ratones huéspedes utilizando la guía aprobada.
2. Extrae el riñón de los ratones huéspedes.
3. Bajo el microscopio de disección, aísle la quimera de la almohadilla de grasa LN y diseccione la LN.

6. Digestión enzimática de los LN transferidos para el análisis de citometría de flujo

1. Haga una incisión en el LN con unas tijeras pequeñas para permitir que las enzimas penetren en el órgano y faciliten la digestión.
2. Coloque un LN en 1,5 ml de Eppendorf que contenga 600 μl de tampón de digestión (RPMI 1% FCS, 2,5 mg/ml de colagenasa D, 100 μg/ml de DNasa I).
3. Incubar durante 30 min a 37 °C en un bloque térmico agitador. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para ayudar a la disociación de los tejidos cada 10 min.
4. Añadir 6 μl de EDTA 0,5 M al tubo y pipetear hacia arriba y hacia abajo para finalizar la disociación de los tejidos.
5. Centrífuga durante 5 min a 490 x g.
6. Vuelva a suspender el gránulo celular en la solución de tinción (PBS, 0,1% de BSA, 5% de suero de rata y 5% de suero de ratón) que contiene la combinación de anticuerpos primarios.
7. Incubar durante 30 min en hielo.
8. Lavar dos veces en PBS
9. Incubar con anticuerpos secundarios durante 20 minutos si es necesario.
10. Lavar 2 veces en PBS.
11. Analice en citómetro de flujo.

7. Análisis de las LNs transferidas por inmunofluorescencia

1. Fijación para la conservación de EYFP durante el proceso de congelación y criosecciones: Colocar el LN en una solución de PBS, 4% de PFA y 10% de sacarosa y dejar actuar durante 3-4 horas.
2. Coloque una sola gota pequeña de compuesto O.C.T. frío en un pequeño trozo de papel de aluminio. Evite las burbujas de aire. Coloque con cuidado el LN sin ningún líquido en el medio de la gota.
3. Congele el órgano colocando el papel de aluminio sobre hielo seco.
4. Corte secciones de 8-10 μm en portaobjetos de vidrio adhesivos adicionales con un criostato. Deje que los portaobjetos se sequen durante 2 horas antes de guardarlos a -20 °C.
5. Los procedimientos de tinción pueden variar según los anticuerpos primarios utilizados y se pueden optimizar a partir del siguiente protocolo. Teñir las secciones con solución de tinción (PBS, 1% BSA) que contenga la combinación de anticuerpos primarios.
6. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
7. Lavar dos veces en PBS durante 5 min
8. Incubar con anticuerpos secundarios durante 1 hora.
9. Lavar dos veces en PBS durante 5 min.
10. Monte las correderas en medios de montaje que contengan DAPI.
11. Capture imágenes con un microscopio de fluorescencia o confocal.

Results

Tres semanas después del trasplante, la quimera de la almohadilla de grasa LN se recupera del riñón. La quimera es ahora muy similar a una LN normal en su propia almohadilla de grasa, y la LN es visible en el centro del tejido adiposo (Figura 1). Si no se puede identificar el LN, es posible que se haya perdido durante el trasplante en el riñón. Al evaluar el papel de los genes potencialmente importantes en el desarrollo de las LN, las LN recuperadas pueden seguir siendo muy pequeñas y más difíciles de en...

Discussion

En este artículo presentamos un método para ensayar y cuantificar la contribución de las células progenitoras del tejido adiposo a los LN en desarrollo y dos técnicas que permiten el análisis de su progenie. La disección de las almohadillas de grasa embrionarias y los LN de los recién nacidos es delicada y requiere habilidades manuales adquiridas con mucha práctica antes de la generación de la quimera real de la almohadilla de grasa LN. Para controlar la calidad de las disecciones, se puede realizar un análisis de citome...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Placa de Petri Estérilina	Appleton Woods	SC265
90 mm Placa de Petri Estérilina	Appleton Woods	SC260
Portaobjetos adhesivos	Surgipath	00202
Anti-ratón CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-ratón CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-ratón CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-ratón IgM Rhodamina Rojo	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-ratón Podoplanina PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-ratón Podoplanina purificada	eBioscience	14-5381
Colagenasa D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Pinzas Dumont #5 Inox Biologie	FST	11252-20	Pinzas extrafinas para disecciones embrionarias y neonatales
Solución EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogénesis
Suero fetal bovino	Sigma	F9665
Tijeras de iris finas endurecidas rectas 11 cm	FST	14090-11	Tijeras pequeñas para disección
Solución HEPES	Sigma	H0887
Filtros de Membrana Isopore 0.8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
Solución de L-Glutamina	Sigma	G7513
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compuesto	Tissue-Tek	4583
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4458
Caja de plástico con tapa	Watkins y Doncaster	E6052	Caja de sándwiches para el cultivo de órganos in vitro. Taladre dos orificios en la tapa para permitir el intercambio de gases en la incubadora de CO2.
RPMI 1640 Medio	Sigma	R0883
Esponjas Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Microscopio estereoscópico	Leica	LEICA MZ95	Microscopio de disección con zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Medio de montaje con DAPI	Vector Laboratories	H-1200