Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

Summary

Se describe la generación de quimeras de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa para el estudio del origen de las células estromales de los ganglios linfáticos. El método implica el aislamiento de ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y almohadillas de grasa embrionaria, la generación de almohadillas quiméricas de grasa de ganglios linfáticos y su transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped.

Abstract

El estroma es un componente clave de la estructura y función de los ganglios linfáticos. Sin embargo, se sabe poco sobre su origen, composición celular exacta y los mecanismos que rigen su formación. Los ganglios linfáticos siempre están encapsulados en el tejido adiposo y recientemente hemos demostrado la importancia de esta relación para la formación del estroma ganglionar. Las células precursoras de los adipocitos migran al ganglio linfático durante su desarrollo y, al unirse al receptor de linfotoxina-b, desactivan la adipogénesis y se diferencian en células estromales linfoides (Bénézech et al.¹⁴). Con base en el potencial del estroma linfoide del tejido adiposo, presentamos un método que utiliza una quimera de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa que permite el rastreo del linaje de los precursores de células estromales de los ganglios linfáticos. Mostramos cómo aislar los ganglios linfáticos recién nacidos y el tejido adiposo embrionario EYFP⁺ y hacer una quimera de almohadilla de grasa LN/EYFP⁺. Después de la transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped, el ganglio linfático incorpora células precursoras de tejido adiposo local y termina su formación. El análisis de la progenie de las células de la almohadilla grasa EYFP⁺ en los ganglios linfáticos resultantes se puede realizar mediante el análisis de citometría de flujo de los ganglios linfáticos digeridos enzimáticamente o mediante el análisis de inmunofluorescencia de las criosecciones de los ganglios linfáticos. Mediante el uso de almohadillas de grasa de diferentes modelos de ratones knockout, este método proporcionará una forma eficiente de analizar el origen de las diferentes poblaciones de células estromales de los ganglios linfáticos.

Introduction

Los ganglios linfáticos (LNs) son órganos clave del sistema inmune situados en sitios estratégicos del cuerpo, a lo largo de la red de vasculatura linfática. Permiten la filtración de antígenos y patógenos y proporcionan un sitio para la presentación de antígenos a los linfocitos y la inducción de respuestas inmunitarias adaptativas. El estroma, que forma la estructura básica de la LN y orquesta el movimiento de los diferentes participantes hematopoyéticos de la respuesta inmunitaria adaptativa, es fundamental para la función de estos órganos. Diferentes poblaciones de células estromales suministran señales esenciales y específicas para los movimientos, localización, ....

Protocol

Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones de SPF en la Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Birmingham de acuerdo con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y del comité de ética local. Todos los procedimientos descritos en este protocolo están cubiertos por una Licencia de Proyecto aprobada tanto por el comité de ética local como por el Ministerio del Interior.

1. Aislamiento de las LN recién nacidas

1. Sacrificar los ratones recién nacidos por luxación cervical.
2. Sección la cabeza y abra el cuerpo con tijeras desde la parte superior de la región torácica hasta la parte ....

Results

Tres semanas después del trasplante, la quimera de la almohadilla de grasa LN se recupera del riñón. La quimera es ahora muy similar a una LN normal en su propia almohadilla de grasa, y la LN es visible en el centro del tejido adiposo (Figura 1). Si no se puede identificar el LN, es posible que se haya perdido durante el trasplante en el riñón. Al evaluar el papel de los genes potencialmente importantes en el desarrollo de las LN, las LN recuperadas pueden seguir siendo muy pequeñas y más difíciles de en.......

Discussion

En este artículo presentamos un método para ensayar y cuantificar la contribución de las células progenitoras del tejido adiposo a los LN en desarrollo y dos técnicas que permiten el análisis de su progenie. La disección de las almohadillas de grasa embrionarias y los LN de los recién nacidos es delicada y requiere habilidades manuales adquiridas con mucha práctica antes de la generación de la quimera real de la almohadilla de grasa LN. Para controlar la calidad de las disecciones, se puede realizar un análisis de citome.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Placa de Petri Estérilina	Appleton Woods	SC265
90 mm Placa de Petri Estérilina	Appleton Woods	SC260
Portaobjetos adhesivos	Surgipath	00202
Anti-ratón CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-ratón CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-ratón CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-ratón IgM Rhodamina Rojo	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-ratón Podoplanina PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-ratón Podoplanina purificada	eBioscience	14-5381
Colagenasa D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Pinzas Dumont #5 Inox Biologie	FST	11252-20	Pinzas extrafinas para disecciones embrionarias y neonatales
Solución EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogénesis
Suero fetal bovino	Sigma	F9665
Tijeras de iris finas endurecidas rectas 11 cm	FST	14090-11	Tijeras pequeñas para disección
Solución HEPES	Sigma	H0887
Filtros de Membrana Isopore 0.8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
Solución de L-Glutamina	Sigma	G7513
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compuesto	Tissue-Tek	4583
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4458
Caja de plástico con tapa	Watkins y Doncaster	E6052	Caja de sándwiches para el cultivo de órganos in vitro. Taladre dos orificios en la tapa para permitir el intercambio de gases en la incubadora de CO2.
RPMI 1640 Medio	Sigma	R0883
Esponjas Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Microscopio estereoscópico	Leica	LEICA MZ95	Microscopio de disección con zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Medio de montaje con DAPI	Vector Laboratories	H-1200