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Artículo de método

Un nuevo procedimiento para la evaluación de las propiedades reforzantes de estimulantes del gusto en las ratas de laboratorio: operante intraoral autoadministración

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DOI:

10.3791/50956

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6 de febrero de 2014

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1Department of Psychology, University of Guelph

En este artículo

Resumen

El presente estudio evalúa un nuevo procedimiento para la evaluación de los efectos reforzantes de soluciones de sabor agradable en ratas de laboratorio: la auto-administración intraoral. Para este fin, en respuesta operante (es decir, palanca de presión) para las infusiones intraorales de soluciones dulces a diferentes concentraciones se midió sobre los coeficientes de continua y progresiva programas de refuerzo.

Resumen

Este documento describe un nuevo método para el estudio de la base-bio de comportamiento de adicción a la comida. Este método combina el componente quirúrgico de la reactividad gusto con los aspectos del comportamiento de autoadministración operante de las drogas. Bajo muy breve anestesia general, las ratas se implantaron con un intraoral (IO) de la cánula que permite la entrega de soluciones de ensayo directamente en la cavidad oral. Animales se prueban en cámaras de autoadministración operante mediante el cual pueden presionar una palanca para recibir IO infusiones de soluciones de ensayo. La auto-administración IO tiene diversas ventajas sobre los procedimientos experimentales que implican beber una solución de un surtidor o operante de responder durante gránulos sólidos o soluciones entregadas en un receptáculo. Aquí, mostramos que la auto-administración de IO se puede emplear para estudiar la auto-administración de jarabe de maíz de alta fructosa (JMAF). Las ratas se probaron para la auto-administración en un (PR) programa de razón progresiva, que evalúa la cantidad máxima de opcomportamiento erant que se emitirá para diferentes concentraciones de HFC (es decir, 8%, 25%, y 50%). Después de esta prueba, las ratas autoadministrados estas concentraciones en un horario continuo de refuerzo (es decir, una infusión para cada presión de la palanca) durante 10 días consecutivos (1 sesión / día, cada 3 horas de duración), y luego se volvieron a analizar en el calendario de PR . En el programa de refuerzo continuo, las ratas tuvieron un menor número de infusiones de concentraciones más altas, aunque la concentración más baja de fructosa (8%) mantiene la auto-administración más variable. Además, las pruebas de PR revelado que 8% tenía un valor de refuerzo inferior a 25% y 50%. Estos resultados indican que la auto-administración IO se puede emplear para estudiar la adquisición y el mantenimiento de la respuesta de soluciones dulces. La sensibilidad de la respuesta operante a diferencias en la concentración y el calendario de refuerzo hace IO auto-administración de un procedimiento ideal para investigar la neurobiología de la ingesta voluntaria Of dulces.

Introducción

El estudio de las bases neurobiológicas y de comportamiento de la adicción a la comida se basa en las observaciones de que, de manera similar a las drogas de abuso, el consumo excesivo de alimentos apetecibles promueve la dependencia psicológica, 1-4 e induce alteraciones en los circuitos de recompensa del cerebro en los seres humanos y de laboratorio 5-6 animales 7-8. Pero, si bien hay varios protocolos y procedimientos para el estudio de las propiedades adictivas de las drogas de abuso en ratas de laboratorio, adaptando estos métodos para evaluar los comportamientos adictivos "" inducidas por alimentos presenta desafíos únicos. El objetivo del presente estudio consistió en aplicar los principios de operante intravenosa (IV) de auto-administración de fármacos a la investigación de la autoadministración operante de soluciones dulces entregados por intraoral (IO) de infusión. El dulce empleada era el jarabe de maíz de alta fructosa (JMAF) porque, aunque controversial, hay evidencia de que el JMAF puede estar vinculado a la moderna epidemia de la obesidad 9-12.

Tradicionalmente, infusiones IO se entregan para estudiar la palatabilidad de los estimulantes del gusto en el sabor experimentos de reactividad 13. En pocas palabras, una cánula de IO se implanta quirúrgicamente en la mejilla de ratas y IO infusiones de diversas soluciones están pasivamente entregado 14. El objetivo es estudiar las reacciones orofaciales de los animales a los estimulantes del gusto. Sin embargo, las cánulas IO también se han implantado crónicamente en el paladar de ratas para determinar si podrían aprender a presionar una palanca para soluciones de auto-INFUSE directamente en la cavidad oral, de ahí el término IO auto-inyección de 15-17. En el presente estudio, se describe un procedimiento que utiliza una cirugía menor y que permite realizar pruebas de autoadministración operante de largo plazo. Este procedimiento tiene varias ventajas significativas sobre los procedimientos tradicionales que implican beber una solución a partir de un tubo de salida (a), o operante de responder durante gránulos sólidos (b), o operante de responder durante gotas de fluido suministrado en un receptáculo(C).

En comparación con (a), la auto-administración IO implica una respuesta operante (es decir, presionando una palanca) y por lo tanto es posible modificar la programación de la regulación de la relación entre los requisitos de respuesta y la entrega de las infusiones de IO. Por ejemplo, mediante el empleo de una relación progresiva (PR) horario, por lo que las respuestas necesarias para infusiones sucesivas aumentan de forma exponencial dentro de un período de sesiones 18, es posible evaluar la cantidad de un animal "quiere" el próximo 19 de infusión. Este importante aspecto de la conducta "en busca de" no se puede evaluar cuando los animales beben una solución a partir de un caño, a menos que un aparato especial que controla el suministro de fluido y monitorea las respuestas se emplea 20. Por otra parte, la auto-administración IO proporciona un medio para comparar los comportamientos motivados por diferentes estímulos reforzantes. Es decir, es posible comparar operante respondieron mantenida por los dulces y otros reforzadores tales como drogas de abuso enlos llamados "estudios de sustitución."

En comparación con (b), la auto-administración IO permite el ensayo de cualquier concentración y cualquier volumen de cualquier aditivo alimentario soluble en agua. Esto es fundamental para estudiar el comportamiento motivado por los dulces, como el JMAF, ya que, a lo mejor de nuestro conocimiento, no hay nódulos disponibles comercialmente sólidos de fructosa, o combinaciones de fructosa y glucosa en diferentes proporciones, que sería adecuado para cámaras operantes. Además, la importancia de controlar y manipular índices de concentración / volumen es obligatoria en experimentos en los que la ingesta puede ser modulado tanto por el valor calórico de una solución (que conduce a la saciedad-nutriente específico) y por la cantidad de esa solución puede ser consumido dentro de un determinado período de tiempo (es decir, plenitud) 21. La auto-administración IO también acorta el retardo entre la respuesta operante y la entrega del reforzador primario, un factor que juega un papel importante en la adquisición y el mantenimientomiento de la conducta operante 16,22-23.

Por último, con respecto a (c), la auto-administración IO permite la entrega de pasivos infusiones IO de cantidades controladas de la solución problema, y esto hace que sea posible medir las respuestas orofaciales de "gusto" (reacción hedónica objetivo como protuberancias lengua 24 -25) y si estas respuestas cambian durante la autoadministración de IO. Además, la capacidad para administrar infusiones IO pasivas tiene aplicaciones importantes para el estudio de la recaída en la búsqueda de alimentos. Es decir, en los estudios de IV fármaco auto-administración, después de períodos de extinción, números primos de drogas (es decir, la administración de una pequeña dosis de la droga 26) pueden "reincorporar" responder 27-28. Por lo tanto, la capacidad de ofrecer infusiones IO sin ninguna acción por parte del animal se puede utilizar para estudiar "comida" cebado reincorporación, así como el potencial reincorporación cruzada entre los alimentos ylas drogas de abuso.

IO auto-administración de soluciones dulces también es preferible a IV y la auto-administración intra-gástrico. De hecho, aunque infusiones IV de fructosa en los seres humanos y animales de laboratorio producen consecuencias fisiológicas similares a los observados después del consumo oral de 29-31, este es un mal modelo de cómo los dulces se consumen normalmente (es decir, por vía oral). Por otra parte, las señales gustativas producidos por la masticación confieren información importante sobre la palatabilidad de los alimentos, y cuando se ha omitido esta etapa del proceso digestivo, el desarrollo de conductas inadaptadas, como comer en exceso se reduce 32-33.

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Protocolo

1. Cuidado de Animales y Vivienda

Todos los experimentos han sido aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph, y se llevan a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales. El estudio actual incluye 22 adultos machos Sprague-Dawley (Charles River, QC) que pesan 200-225 g al inicio del experimento.

  1. Ratas casas individuales y mantenerlas en un ciclo de luz / oscuridad inversa (7:00 am OFF - 19:00 ON) con acceso ad libitum a comida y agua, excepto cuando se indique lo contrario, o durante las pruebas de comportamiento que se produce durante el ciclo activo.
  2. Se habitúan ratas a la sala de colonia y manipulación humana pesando día durante una semana antes de la cirugía.

2. La canulación cirugía intraoral: Materiales y Procedimientos

El intraoral (IO) de la cirugía y materiales se describen en Limebeer et al. 14

  1. Para la construcciónt la cánula IO, cortar un trozo de tubo de plástico de polietileno de aproximadamente 130 mm de longitud (diámetro interno de 0,86 mm y un diámetro exterior de 1,27 mm).
  2. El tubo para ser fijado en la cavidad oral requiere un extremo con pestaña (~ 5 mm de diámetro). Crear este extremo con pestaña calentando el extremo del tubo con un soldador para 2-5 seg y luego aplanar rápidamente el borde calentada del tubo contra una superficie plana. Cortar un disco de malla quirúrgica (aproximadamente 6-7 mm de diámetro para encajar alrededor del diámetro del extremo de brida de la cánula) y el hilo que en la longitud del tubo hasta que el disco se apoya contra la parte posterior del extremo de brida de la cánula IO.
  3. Para cada cánula IO, cortar un disco adicional quirúrgica de malla (8 mm de diámetro) y tres cuadrados de una banda elástica (6 mm x 6 mm; véase la Figura 1).
  4. Esterilizar la cánula IO, discos de malla quirúrgica, y los cuadrados elásticos en una solución antibacteriana para un mínimo de 24 horas antes de la cirugía.
  5. Antes de la cirugía, unutoclave todas las herramientas quirúrgicas y desinfectar el campo quirúrgico. Entre las cirugías, utilice un esterilizador de cuentas de vidrio para esterilizar instrumentos, y con una redecilla, guantes de nitrilo, y máscaras quirúrgicas para mantener las condiciones de asepsia.

Analgesia y anestesia

  1. Aproximadamente 30 minutos antes de la cirugía administrar una inyección subcutánea (SC) de la Depocillin antibiótico (0,33 mg / kg) y el analgésico meloxicam (5 mg / kg SC).
  2. Inducir la anestesia general usando isoflurano (4% de inducción y mantenimiento 3%).
  3. Una vez que las ratas no responden a la pizca dedo del pie, y antes de hacer ninguna incisión, use un hisopo con punta de algodón para administrar un anestésico tópico a lo largo de la mejilla izquierda interna de ratas donde la cánula se va a implantar, y se inyecta un anestésico local como la lidocaína HCl al el lugar de la incisión de la aguja de biopsia (base del cuello) y la tapa de la cabeza (cuero cabelludo).
  4. Aplicar lubricante ungüento para los ojos a ambos ojos antes del comienzo de aumentory.

Los procedimientos quirúrgicos

  1. Shave un parche de 10 mm x 10 mm de pelo en la base del cuello. Utilice gasas estériles para fregar y limpiar la zona afeitada en el siguiente orden: el jabón antibacteriano, isopropílico al 70% de alcohol y Betadine.
  2. Inserte una aguja de acero inoxidable 15 en la base del cuello y moverlo por vía subcutánea alrededor de la oreja a la mejilla izquierda. Coloque la punta de la aguja y pasarla a través de la mejilla detrás del primer molar en el interior de la cavidad oral.
  3. Pase la cánula IO a través de la punta de la aguja que sobresale de la cavidad oral y luego retire la aguja dejando sólo la cánula IO.
  4. Pase un disco de malla quirúrgica seguida por tres discos elásticos cuadrados sobre la parte exterior de la cánula IO y atraerlos a la piel expuesta en la parte posterior del cuello para estabilizarlo.
  5. Enjuague la cánula IO con un enjuague bucal antibacteriano
  6. Antes del comienzo de la cirugía, modificar un perno de nylon(28 mm de longitud; punto 4 mm; 8 mm de la cabeza) para eliminar su cabeza y tallar una ranura de 2 mm a lo largo de la longitud de la rosca (véase la Figura 2).
  7. Afeitarse a 10 mm x 20 mm tira de pelo a lo largo de la línea media de la cabeza. Utilice gasas estériles para fregar y limpiar la zona afeitada en el siguiente orden: el jabón antibacteriano, isopropílico al 70% de alcohol y Betadine.
  8. Utilice un bisturí quirúrgico para realizar una incisión larga de 20 mm a lo largo de la sutura sagital. Use un taladro de mano para hacer 4 agujeros (2 de cada lado de la sutura) y el uso de un destornillador de mano para asegurar los cuatro tornillos de los joyeros en el cráneo.
  9. Coloque el perno en el centro de los cuatro tornillos joyeros con la ranura de posicionado hacia la parte posterior del animal. Montar el perno en el cráneo de la rata mediante la construcción de un casquete con cemento dental (utilizar cemento dental suficiente para cubrir la superficie de los tornillos joyeros). Permitir que el cemento dental se seque antes de retirar al animal del campo quirúrgico y terminar la anestesia.
la vigilancia y cuidado post-operatorio

  1. Individualmente casa ratas en jaulas camas inmediatamente después de la cirugía y vigilar de cerca durante 24 horas.
  2. Administrar una segunda inyección del Meloxicam 24 horas después de la cirugía analgésico y lavar la cánula IO con un enjuague bucal antibacterial una vez / día durante tres días.

Dale ratas de 3-5 días para recuperarse de la cirugía antes del comienzo del experimento.

3. IO procedimientos de auto-administración

Aparato

Para la autoadministración, se utilizan cámaras de plexiglás de condicionamiento operante, y cada cámara se encierra en una caja de madera contrachapada de atenuación del sonido más grande. Cada cámara de condicionamiento operante tiene una luz de la casa (28 V) y dos palancas retráctiles (activos e inactivos) situados en lados opuestos de la cámara, 8 cm por encima del suelo. La palanca activa está conectada a una bomba de infusión salidas posicionadoide la cámara de aislamiento acústico y una luz blanca (28 W) está situado 3 cm por encima de ella para servir como una luz de estímulo emparejado con la entrega de las infusiones de IO. La palanca inactiva sirve para el control de la línea de base, la conducta operante no reforzada; presionar esta palanca no tiene consecuencias, pero se registran todas las pulsaciones.

Comida

  1. Proporcionar las ratas con un pienso estándar para ratas (3,1 kcal / g) en su jaula.
  2. Diluir el jarabe de maíz rico en fructosa alta (fórmula 55%) a tres concentraciones diferentes (8% = 0.026 l kcal/80 infusión; 25% = 0,08 kcal/80 l de infusión; 50% = 0,17 kcal/80 l de infusión), utilizando agua de ósmosis inversa. Estas concentraciones se seleccionan porque cada uno produce una viscosidad que sea apropiada para entregar rápidos infusiones (2,5 seg) IO dado el aparato experimental (es decir, diámetro de jeringas y tubos).

Privación de alimentos

Con el fin de facilitar la adquisición deAutoadministración IO, sino promover el crecimiento normal, las ratas se reciclan a través de períodos de privación de alimentos y acceso ad libitum a comida para ratas estándar.

  1. Pesar ratas diariamente a las 7 pm y retirar comida del comedero de la jaula.
  2. Al día siguiente, pesan las ratas a las 12:00 horas (aproximadamente 18 horas más tarde) y comenzar la auto-administración IO por 13:00.
  3. Ratas Vuelva a sus jaulas a las 4:00 pm y facilitar el acceso ad libitum al perro chino durante 3 horas consecutivas. A continuación, registrar el peso de las ratas y la cantidad total de pienso consumido durante las tres horas. Reanudar la privación de alimentos como se describe.

Procedimiento de auto-administración general IO

Operante de responder durante IO infusiones de JMAF se evalúa en PR y horarios continuos de refuerzo. Las ratas se ensayaron en la auto-administración IO hasta la ingesta es estable como se define por: 1) una diferencia significativa en la respuesta entre activo y INACtiva palancas durante al menos 2 sesiones consecutivas, y 2) la variación inferior al 20% en el número de infusiones ganadas por sesión durante 2 sesiones consecutivas. Cada sesión comienza 6 horas en el ciclo de oscuridad y tiene una duración de 3 horas. La fase de adquisición consiste de 10 sesiones consecutivas de auto-administración IO en un horario continuo de refuerzo, y las ratas reciben una única banda de la prueba 24 horas antes del inicio de la adquisición (prueba de PR I) y 24 h después de la sesión de adquisición final (PR Prueba II). Para las pruebas de relaciones públicas, el punto de interrupción (BP) se define como la última infusión recibida antes de la cesación de responder en la palanca activa durante al menos 1 h 18.

  1. Ratas del contrapeso sobre la base de los pesos tomadas durante tres días antes del inicio del experimento y asignar ratas para auto-administrarse una de las tres concentraciones de fructosa: 8%, 25%, o 50%.
  2. Pesar ratas a las 12:00 pm y transferirlos desde la sala de colonia a la sala de pruebas en sus jaulas. Para eliminar alimentos o Bedding que pueden acumularse en la cánula IO, bombear aire a través de la cánula con una jeringa 12 ml fijo con una aguja 16 G con 50 mm de tubo de polietileno (diámetro interno de 1,14 mm y un diámetro exterior de 1,57 mm) fijadas al extremo.
  3. En la cámara operante, conecte la cánula IO a un tubo Tygon (diámetro interior de 0,02 mm y un diámetro externo de 1,53 mm) por un eje construida de una aguja de calibre 20 modificado (quitar el cubo de plástico y punta biselada). Coloque la parte inferior del tubo (es decir, más cerca del animal), dentro de la arboleda del perno. La parte superior de la tubería está conectado a un eslabón giratorio, y protegido por un resorte. Conectar la base del resorte a la rosca del perno montado en la cabeza de la rata.
  4. Dale ratas cinco minutos para aclimatarse a la cámara operante y luego iniciar la sesión de auto-administración de IO. La sesión de auto-administración IO se inicia con la activación de la luz de la casa, la entrada de las dos palancas retráctiles, y la iluminación delestímulo de luz por encima de la palanca activa durante 30 segundos.
  5. Para PR Ensayo I, utilice el programa de relaciones públicas descrito por Richardson y Roberts18 (relación de respuesta escalada = (5 e (el número de inyección x 0,2)) - 5).
  6. Para las sesiones de adquisición de 1-10, use un horario continuo de refuerzo por el que cada prensa sobre los resultados palanca activa en la entrega de una infusión de 80 l de la solución de prueba de más de 2,5 seg.
  7. Para dar tiempo suficiente para la ingestión, imponer un período de tiempo de espera de 27,5 segundos en el que la palanca activa se retrae y la luz de estímulo se activa (es decir, las ratas pueden obtener una infusión IO cada 30 segundos). No imponer un límite en el número de infusiones que se pueden obtener dentro de cada sesión de auto-administración IO.
  8. Si la rata no hace una respuesta sobre la palanca activa durante 20 minutos consecutivos, cebar la rata (abrir la cámara operante y facilitar la rata presionando una vez sobre la palanca activa). Prime a los animales cada 20 minutos hasta 5x/session dusonar los tres primeros días de la única adquisición.
  9. Administrar la segunda prueba de PR con los parámetros que se describen en el paso 3.10.
  10. Después de las sesiones de auto-administración IO, eliminar las ratas de las cámaras operantes, enjuagar la cánula IO con agua 2,0 ml utilizando los mismos materiales descritos en 3.7, y volver ratas a su jaula de alojamiento en la sala de colonia.
  11. Después de tres horas de acceso ad libitum a comida para ratas, ratas de peso a las 7:00 pm, retire los alimentos del comedero, y curriculum vitae de la privación de alimentos.

Datos de la auto-administración se analizan utilizando dos factores de medidas repetidas análisis de varianza (ANOVA). Se emplearon múltiples comparaciones utilizando el método de Student-Newman-Keuls (α = 0.05) para explorar cualquier interacción significativos o efectos principales.

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Resultados

Adquisición de autoadministración IO

La Figura 3 representa operante de responder en las palancas activas e inactivas durante la auto-administración de 8%, 25%, o 50% JMAF durante 10 sesiones consecutivas. Las ratas adquieren IO autoadministración de JMAF en los tres primeros períodos de sesiones y mantener palanca activa estable de responder (como se describió anteriormente) para el resto de su adquisición. Diferencias dependientes de la concentración en las respuesta...

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Discusión

El estudio actual muestra un nuevo enfoque para la evaluación de las propiedades reforzantes de soluciones dulces mediante la combinación de métodos empleados tradicionalmente para estudiar el comportamiento motivado por las drogas de abuso (intravenosa autoadministración operante) y para evaluar la palatabilidad de los estimulantes del gusto (sabor reactividad mediante infusiones intraorales). Para este fin, bajo muy breve anestesia isoflurano inducida, las ratas se implantaron con una cánula de IO que permite la entre...

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Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estos estudios fueron apoyados por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a FL y una Beca de Postgrado canadiense (CGSD) de NSERC a AM.L.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reagents
MeloxicamBoehringer Ingelheim Canada Ltd.De la farmacia del Colegio Veterinario de Ontario
Penicilina Procaína GPen Acuosa, Wyeth SaludAnimal De la farmacia del Colegio Veterinario de Ontario
Lidocaína HCl 2%De la farmacia del Colegio Veterinario de Ontario
Marcaine 0.5 %De la farmacia del Colegio Veterinario de Ontario
Pomadalubricante para los ojosEl producto se puede comprar en cualquier farmacia
2% Lidocaína viscosa oral (anestésico tópico)Pharmascience Inc.CDMV # 14705Frasco de 100 ml
Isoflurano USPPharmaceutical Partners of CanadaCDMV # 108737frasco de 250 ml
Bacti-StatMerck Sante AnimaleCDMV # 6449Botella de 3.785 L
Alcohol isopropílico (70%)Perdu PharmaFisher # MPX18404botella de 4 L
Betadine 10%McKesson CanadaCDMV # 104826botella
de 500 mlSuper GermipheneCeva Animal HealthCDMV # 103629botella de 454 ml
Clorhexideno (Novadent)ZoetisCDMV # 8908236 ml
Jarabe de maíz de alta fructosaNatures FlavorsJMAF-55 botella de1 galón
Materiales
Tubería de PE90Becton Dickinson and Company VWR# CA-63019-080A100 pies/bobina
Tubería PE160Becton Dickinson and CompanyVWR # CA-63018-747100 pies/bobina
Piezas pequeñas Inc.CMP-0297-D
Soldadorproducto se puede comprar en cualquier ferretería
#64 Bandaselásticas Grapas Suministros de oficinaArtículo # 13556El producto se puede comprar en cualquier tienda de artículos
de oficina 15 G Paredes delgadas Agujas deVWR # CABD110812 agujas/paquete
Maquinilla de afeitar eléctrica (hoja de 1/2 pulgada de ancho)El producto se puede comprar en cualquier mascota tienda
de suministros Agujas de deslizamiento de precisión Agujas de 20 g (1 y frac12; pulgadas)Becton Dickinson and CompanyFisher # 14-826D
Agujas de deslizamiento de precisión Agujas de 16 g (1 y frac12; pulgadas)Becton Dickinson and CompanyFisher # 14-826-5D
Cámaras de acondicionamiento operanteMed Associates Inc.ENV-008-CTC
Cámara atenuadora de sonidoMed Associates Inc.ENV-018M
MED PC IV softwareMed Associates Inc.SOF-735
Bombas de jeringaRazel Scientific Instruments
Conjunto giratorio de plástico desechableMed Associates Inc.PHM-115I
Tubo Tygone MicroboreSaint Gobain Performance PlasticsFisher # 1417015B500 pies/bobina
botella de Malla de polipropileno de El 3,5 pulgadas

Referencias

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