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Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

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DOI:

10.3791/50959

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15 de julio de 2013

 , 
1Torrey Pines Institute for Molecular Studies, 2Cascade LifeSciences Inc.

En este artículo

Resumen

El dispositivo de cámara de flujo tridimensional es una novela In vitro Tecnología para la evaluación cuantitativa y paso a paso de la cascada de la extravasación de las células circulantes en condiciones de esfuerzo cortante fisiológico. Por consiguiente, el dispositivo se llena una necesidad crítica para los estudios básicos, preclínicos y clínicos de la migración celular.

Resumen

La extravasación de las células de la sangre circulante juega un papel central en muchos procesos fisiológicos y patofisiológicos, incluyendo células madre del tumor y la metástasis homing. El dispositivo de cámara de flujo en tres dimensiones (en lo sucesivo el dispositivo 3D) es una novela en la tecnología in vitro que recrea esfuerzo cortante fisiológico y permite que cada paso de la cascada de la extravasación de células para ser cuantificado. El dispositivo de 3D consiste en un compartimento superior en el que las células de interés circulan bajo esfuerzo cortante, y un compartimiento inferior de pozos estáticas que contienen los factores quimiotácticos de interés. Los dos compartimientos están separados por inserciones porosas recubiertas con una monocapa de células endoteliales (CE). Un segundo inserto opcional con células microambientales de interés puede ser colocado inmediatamente debajo de la capa de CE. Una unidad de intercambio de gases permite que la tensión óptima de CO 2 que se mantiene y proporciona un punto de acceso para añadir o retirar las células o compuestos durante elexperimento. Las células de prueba circulan en el compartimiento superior a la tensión de corte deseada (velocidad de flujo) controlado por una bomba peristáltica. Al final del experimento, las células circulantes y migrado se recogen para análisis adicionales. El dispositivo de 3D se puede utilizar para examinar células rodando por CE y la adhesión a bajo esfuerzo de corte, la transmigración en respuesta a gradientes de quimioquinas, resistencia a la tensión de cizallamiento, formación de clúster, y la supervivencia celular. Además, el segundo inserto opcional permite que los efectos de la diafonía entre CE y células microambientales a ser examinados. Las aplicaciones de traslación del dispositivo de 3D ​​incluyen las pruebas de los fármacos candidatos que la migración de células diana y la predicción del comportamiento in vivo de las células después de la inyección intravenosa. Por lo tanto, el nuevo dispositivo de 3D es una herramienta versátil y de bajo costo para estudiar los mecanismos moleculares que median la extravasación celular.

Introducción

Extravasación celular es el proceso por el cual las células circulantes salen del torrente sanguíneo y es un componente crítico de muchas respuestas fisiológicas en el cuerpo. El proceso también es importante para la regeneración de tejidos, como por ejemplo, cuando las células terapéuticas movilizados desde los tejidos en los vasos sanguíneos (o inyectada por vía intravenosa) migran a través de la vasculatura y salen de la circulación a los sitios de lesión o degeneración. La extravasación es también un componente crítico de la patogénesis de muchas enfermedades, incluyendo la inflamación, rechazo inmune, autoinmunidad, y metástasis tumoral.

La extravasación es un proceso de múltiples pasos complejo que involucra la interacción de las células con células endoteliales (CE) que circulan en condiciones de flujo fisiológico. El proceso comprende (a) de laminación celular, (b) la adhesión firme a la superficie luminal de la CE, y (c) transmigración a través de la CE. Es importante destacar que, cada paso de la cascada de la extravasación está regulada por un subconjunto de Cell de tipo específico y moléculas específicas de la especie. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados que regulan la extravasación de subconjuntos específicos de células no se entienden bien, en gran parte debido a la dificultad técnica de la recapitulación de las condiciones en el torrente sanguíneo. El nuevo dispositivo de 3D descrito aquí está diseñado para superar estos desafíos técnicos y permitir experimentos a realizar que mejoren nuestra comprensión de la biología de la migración celular.

Las moléculas que median la migración de las células son importantes dianas terapéuticas. Una comprensión detallada de los eventos moleculares que controlan la migración de tipos celulares específicos ayudará en la identificación de nuevas dianas para la terapéutica o para la inhibición de la extravasación. Por ejemplo, las intervenciones que mejoran la migración de las células madre terapéuticas (ya procedan de los tejidos fetales adultos, neonatal o incluso desde) hacia los sitios de lesión o degeneración serían de gran utilidad en la regeneración de tejidos.Existe un interés creciente en la generación in vitro de las células madre terapéuticas, incluyendo las células pluripotentes derivadas de fuentes, y en las células ex vivo manipuladas madre adultas (ampliado, manipulado genéticamente, y pretratados con diversas enzimas) 1. Por lo tanto, hay una necesidad de nuevas tecnologías para evaluar la calidad de las células madre antes de que se utilizan con fines terapéuticos. Entre otros parámetros, las células deben ser capaces de salir de manera eficiente la circulación, porque los tratamientos para los trastornos multifocales pueden requerir la administración intravenosa de las células madre 2. De hecho, uno de los retos actuales de la biología de células madre es superar la extremadamente baja eficiencia con la que las células madre en casa a los sitios de daño tisular 3-6, destacando la necesidad de abordar este vacío en nuestra comprensión de la migración de células madre. En contraste, las estrategias que bloquean la migración de células por la orientación moléculas autodirigidas específicos sería útil para el tratamiento de enenfermedades inflamatorias y autoinmunes, así como cáncer metastásico. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares que median en las interacciones entre las células circulantes y CE durante la migración celular y la extravasación es relevante para la medicina traslacional y el descubrimiento de fármacos, así como para la ciencia básica.

Hay actualmente un número de métodos disponibles para estudiar diferentes aspectos de la migración celular. Sin embargo, estos métodos tienen deficiencias que se pueden superar con el nuevo dispositivo 3D.

Los modelos animales:

Los modelos animales, tales como ratones inmunocomprometidos y ratones manipulados genéticamente, han sido herramientas útiles para estudiar la migración de las células humanas in vivo. Sin embargo, un inconveniente significativo de estos modelos es que las células humanas interactúan mal con moléculas de adhesión presentes en el ratón de CE, en parte debido a diferencias en las secuencias específicas de la especie en muchas moléculas de superficie celular. Por lo tanto, el uso de los roedores para estudiarla migración celular humana es poco probable que refleje auténticamente los eventos en los lechos vasculares de órganos específicos humanos. Además, en modelos in vivo no son adecuados para el cribado de alto rendimiento de candidatos a fármacos. El convencional en modelos in vivo utilizando para estudiar células homing no discriminan entre las diferentes etapas de la cascada de la extravasación, por lo que es difícil de identificar y apuntar nuevas moléculas mensajeras. El enfoque de microscopía intravital fue desarrollado para hacer frente a esta necesidad y ha sido informativo, sin embargo, esta técnica es extremadamente tiempo y mano de obra intensiva 7,8.

Ensayos de transmigración estáticos:

Transwell o Boyden cámara de ensayos de migración celular medida a través de una membrana porosa y son ampliamente utilizados en los estudios de migración. El ensayo tiene la ventaja de que puede ser usado para estudiar no sólo la motilidad celular y las interacciones célula-matriz extracelular (ECM), sino también la migración mediada por quimioquinas de célulasa través de una monocapa CE crecido en las membranas porosas. Desafortunadamente, el fenotipo y la función de CE en condiciones estáticas difieren significativamente de los bajo un flujo fisiológico 9,10. Por lo tanto, los acontecimientos quimiotácticos que se producen en ensayos Transwell no imitan fielmente las interacciones entre las células y la migración de CE en virtud del esfuerzo cortante. Además, la etapa de "balanceo" de la cascada de homing, que añade una dimensión extra de la selectividad para el proceso general, no se produce en los ensayos Transwell estáticas. Por lo tanto, mientras que esta tecnología no permitir la evaluación cuantitativa de la migración celular mediada por quimioquinas a través de la monocapa CE, que está limitada por su incapacidad para proporcionar la tensión de cizallamiento que imita el flujo de sangre in vivo.

Ensayos de bajo esfuerzo cortante:

Tensión de cizallamiento de la pared se sabe que juega un papel importante en la regulación de la función EC 9,10. Las fuerzas de cizallamiento inducen una activación rápida de cascadas de señalización, transcfactores ription y la expresión diferencial de genes en EC 11,12. Esta información condujo al desarrollo de la próxima generación de ensayos de adhesión - cámaras de flujo laminar paralelas y capilares - para estudiar rodamiento y adhesión de las células a la CE bajo condiciones de esfuerzo cortante 7,13. El factor limitante para estos ensayos es que se puede medir solamente la rodadura y la adherencia, pero no distinguen entre un celular adherente que pasaría a transmigrar y una célula adherente que está "detenido" en la monocapa CE y no transmigrar. Por otra parte, estos ensayos no pueden medir la migración de células hacia un gradiente de quimioquinas.

Varios informes han descrito la capacidad de las células adherentes a arrastrarse debajo de una monocapa CE crecido en portaobjetos de vidrio en condiciones de flujo 14. Las limitaciones a esta técnica de rastreo incluyen: analiza sólo un número limitado de células, sino que es no cuantitativa, sino que analiza la célula que se arrastra en la matriz y celsuperficie de l, pero no la migración hacia un gradiente quimiotáctico, y no permite que las células transmigrantes a aislarse. Por lo tanto, aunque este ensayo tiene la ventaja de la aplicación de esfuerzo cortante a la monocapa de CE, no puede cuantificar la migración de células hacia un gradiente de quimioquinas.

La novedosa tecnología 3D descrito aquí supera muchos de estos defectos mediante la combinación de la fuerza de corte (compartimiento superior) con un gradiente de quimioquinas estática (compartimiento inferior) y permite la evaluación cuantitativa de cada paso de la cascada de extravasación (Figura 1). El dispositivo también se puede utilizar para investigar cómo la diafonía entre CE y el microambiente influye en la capacidad de CE para apoyar la extravasación de células circulantes. El siguiente protocolo describe la metodología paso a paso para utilizar el dispositivo de cámara de flujo 3D.

Protocolo

1. Prepare las tapas superior e inferior para el crecimiento celular mediante el recubrimiento de colágeno

  1. Calcular el número de insertos necesarios para el experimento. Coloque cada inserto en una caja de Petri estéril separada (35 x 10 mm) y esterilizar por irradiación (11 Gy).
  2. Preparar la solución de colágeno para el recubrimiento de membranas: 50 g / ml, 154 l por inserción (inserte área de superficie 1,54 cm 2).
  3. Coloque varias gotas (~ 20 l por gota) de solución de colágeno en un círculo en la superficie de la membrana de inserción (no deje que la punta de la pipeta toque la superficie) y a continuación, añadir con cuidado el resto de la alícuota para formar una gran caída en la superficie de la membrana. Asegúrese de que la solución de colágeno se mantiene semiesférica y no drena de la superficie de la membrana.
  4. Cubrir la placa de Petri con una tapa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en una superficie plana.
  5. Aspirar la solución de colágeno y lavar la membrana una vez cubriendo con 160 l de PBS.
  6. Aspirate la PBS y reemplace la tapa. Si se utiliza el mismo día, coloque la placa de Petri en un lugar seco a temperatura ambiente. De lo contrario, coloque el plato en 4 ° C y utilizar el inserto dentro de 7 días.

2. Cultura células endoteliales en las inserciones superiores

  1. Preparar suspensión CE en medio de cultivo deseado. Asegúrese de que la viabilidad celular es> 98% y el uso inmediatamente.

Nota: Para la vena umbilical humana EC (HUVEC), 4 x 10 5 células en 160 l por inserción se utiliza.

  1. Tome las cápsulas de Petri con inserciones de colágeno recubiertas preparadas en el apartado 1, no retire las inserciones de los platos. Coloque varias pequeñas gotas de la suspensión de células (aproximadamente 20 l por gota) en un círculo sobre la superficie de la membrana recubierta con colágeno (no deje que la punta de la pipeta toque la superficie) y a continuación, añadir con cuidado el resto de la suspensión de células para formar una gota grande. Asegúrese de que la suspensión de células se mantiene hemis pherical y no drena de la superficie de la membrana.
  2. Reemplace las tapas y coloque los platos en un 5% de CO 2 incubadora de cultivo celular y se incuba (sin agitación) a 37 ° C durante 30 minutos para permitir que las células se unan a la membrana.
  3. Suavemente agregar 5 ml de medio de cultivo a cada placa de Petri asegurar que el inserto permanece en el fondo del plato y está completamente cubierto por el medio. Reemplace las tapas y colocar cuidadosamente los platos de nuevo en la incubadora. Cultivar las células a 37 ° C durante la noche.
  4. Usa el mismo enfoque para preparar el segundo inserto inferior (opcional) con las células que representan el microambiente local, que se coloca por debajo del inserto que contiene la capa de CE.

Nota: si las inserciones inferiores se incluyen en los experimentos, los insertos superior e inferior se conectan primero el uno al otro antes de colocar los insertos en el dispositivo de 3D ​​(Figura 4B).

e "> 3. Montar el dispositivo de cámara de flujo 3D

  1. Atornillar las placas superior e inferior, las placas de conectar a la unidad de intercambio de gas usando un tubo, colocar el dispositivo ensamblado en una bolsa de plástico limpia, y esterilizar la bolsa y el contenido por irradiación (11 Gy).
  2. Extraiga una bandeja-plataforma de la incubadora de cultivo celular, el lugar en una campana de cultivo de tejido estéril, spray con etanol al 70%, limpie, y luego cubrir la bandeja con una gran toalla estéril.
  3. Coloque la bolsa de plástico irradiado en el capó, retire el dispositivo de la bolsa y colóquela en la bandeja de la incubadora estéril. Conectar el dispositivo a la bomba peristáltica con el tubo proporcionado. Programa de la bomba para una velocidad óptima de 0,2 ml / min.

Nota: Para conectar la bomba con la toma de corriente, extruir el cable eléctrico a través del agujero en la parte trasera de la incubadora. Utilice el enchufe ladrón alrededor del cordón para asegurar que el agujero es hermético.

  1. Colocar 5-7 ml de medio de cultivo deseada en un tubo de 15 ml estéril (para la "entrada").

4. Prepare el dispositivo de cámara de flujo 3D

  1. Desconectar el tubo de entrada de la toma tirando de la aguja de metal de la tubería (utilizar pequeñas servilletas estériles para mantener la esterilidad de la tubería). Utilice la aguja de metal conectado a la tubería como una "entrada" y al final desconectada del tubo como un "outlet". Coloque la entrada de aguja de metal en el tubo de 15 ml con los medios de comunicación; colocar la salida en el tubo vacío de 15 ml.
  2. Encienda la bomba de manera que el flujo es en sentido antihorario y establece la velocidad de flujo a 0,2 ml / min. Permitir la presión negativa para extraer el medio desde el tubo de entrada de 15 ml en el tubo y parar la bomba cuando el medio alcanza el extremo de la tubería inmediatamente antes de que se conecta al dispositivo (Figura 2, parada # 1).
  3. Desatornillar las placas superior e inferior del dispositivo. Retire con cuidado la placa superior y el lugar 1500 - 1550 l de medium (ya sea medio solo o además de las quimiocinas experimentales) en los pocillos inferiores. Asegúrese de que el bien contiene medio suficiente para formar un hemisferio que alcanza aproximadamente 1 - 2 mm por encima de la placa inferior.
  4. Transferir el inserto preparada a partir de la placa de Petri a los pocillos de la placa inferior usando pinzas estériles, asegurándose de que no queden atrapadas burbujas por debajo de los insertos. Aspirar cualquier medio que aparece en la superficie de la placa inferior para asegurar que la placa se mantiene seco. Coloque la placa superior de la espalda sobre la placa inferior y volver a conectar las placas con los tornillos.
  5. Inmediatamente gire en la bomba peristáltica y permita que el medio a fluir a través del dispositivo de 3D. Elevar el extremo de salida del dispositivo y mantener la cámara en esta posición para evitar la formación de burbujas en el espacio entre las placas.
  6. Dejar que el medio para llenar la cámara y el tubo que conecta la cámara a la unidad de intercambio de gases. Detenga inmediatamente la bomba antes de que el producto llega hasta el correo gasunidad xchange (Figura 2; Detener # 2). Place 3 ml de medio en la unidad de intercambio de gases, encienda la bomba y deje que las burbujas de aire para escapar a través de la unidad de intercambio de gas. Elevar la unidad de intercambio de gas para permitir que el medio para llenar el tubo que sale de la unidad de intercambio de gas y parar la bomba cuando el producto llega hasta 2 - 3 cm antes de que el extremo de la tubería de salida (Figura 2, parada # 3).
  7. Conectar la aguja de metal entrada a la salida usando pequeñas servilletas estériles. Vuelva a programar la bomba de manera que el medio fluye en la dirección opuesta (a la derecha) hacia la unidad de intercambio de gases y asegurar las burbujas de aire se eliminan una vez que alcanzan la unidad de intercambio de gases. Compruebe que no queden burbujas de aire en el sistema.
  8. Vuelva a programar la bomba para que el medio de los flujos de la izquierda. Añadir 100 l de la suspensión de células de prueba a la unidad de intercambio de gases. Cerrar la tapa de la unidad de intercambio de gases, colocar la bandeja con el sistema de trabajo de nuevo en la incubadora, y permiten que las células de ensayo a CIRCULATe en el dispositivo 3D a 37 ° C durante el tiempo deseado.

Nota: Limpie el cable eléctrico de la bomba con etanol al 70% y se coloca dentro de la incubadora.

5. Terminar la prueba y tomar muestras para ensayo

  1. Retire la bandeja con el sistema de trabajo de la incubadora y el lugar en el capó. Parar la bomba, desconecte la entrada y la salida, y colocar los extremos en tubos de vacío estériles de 15 ml.
  2. Encienda la bomba y recoger la suspensión celular del sistema, el lugar de la suspensión de células en hielo, en su caso, hasta su uso.
  3. Desmontar la cámara quitando los tornillos y levantando la placa superior. Quite los insertos de la placa inferior y transferirlos a placas de Petri.

Nota: Los insertos se pueden teñir para visualizar y contar las células in situ (violeta cristal al 0,05% en dH 2 O) o tripsina para recoger la CE para su posteriorpruebas.

  1. Retire el medio y las células de los pocillos inferiores en tubos y se centrifuga durante 5 min a 210 x g. Eliminar el sobrenadante, lavar y resuspender las células como se desee, y procesar las células de acuerdo con los objetivos experimentales específicas (discutido más adelante).

Resultados

La médula ósea murina derivada de la línea STR EC-12 se cultivó en placas con 5 poros m. La tasa de crecimiento de CE se monitorizó con un microscopio y cuando la CE fueron 100% confluentes, las inserciones se transfirieron a los pocillos en el compartimiento inferior del dispositivo 3D. Inmediatamente antes de colocar los insertos, los pozos de el compartimiento inferior se llenaron con medio de cultivo solo (control negativo) o con medio suplementado con células estromales derivadas de factor 1 (SDF-1; 5 ng / ml y 50 ng / ml). A partir de entonces, el dispositivo 3D fue ensamblado y la cámara se llenó con medio como se describe en el protocolo. Las células de prueba que se distribuirá en el compartimiento superior del dispositivo fueron recién cosechadas células de la médula ósea murina (3,5 x 10 6 células por cámara). Un esfuerzo de cizallamiento definida de 0,8 dyn / cm 2 se aplicó mediante el establecimiento de la velocidad de la bomba peristáltica a 0,2 ml / min. El sistema de trabajo completo se colocó a continuación en el 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C y el ceLLS se permite la circulación e interactuar con la monocapa CE durante 4 horas. Al final de ese tiempo, se recogieron las células circulantes, la cámara fue desmontado, y se eliminaron los insertos como se describe en el protocolo. Las células fueron cosechadas a partir trasmigrados los pocillos inferiores, lavan, se resuspenden en medio fresco, y se transfieren a las culturas metilcelulosa suplementado con factores de crecimiento hematopoyéticos para (CFC) ensayo de células formadoras de colonias (Figura 3). Como era de esperar, se encontró un número significativamente mayor de CFC había migrado a través de la monocapa CE a los pocillos que contienen 50 ng / ml de SDF-1 que a los pocillos que contenían 5 ng / ml de SDF-1 o medio solo.

Como hemos descrito anteriormente, ninguna de la corriente en técnicas in vitro disponibles para estudiar la migración de células son capaces de poner a prueba el efecto del microambiente local, en la capacidad de CE para apoyar la extravasación de células que migran. Para ilustrar cómo esto se puede lograr con el dispositivo 3D, nosexaminado extravasación de las células hematopoyéticas que circula a través de una capa de CE y una capa de células estromales de médula ósea. Para ello, un segundo inserto (inferior) que contiene una capa de células del estroma se yuxtapone a la inserción superior que contiene la monocapa CE en la placa inferior (Figura 4). A continuación, El experimento se realizó como se ha descrito anteriormente y las células se cosecharon trasmigrados de los pocillos y se contaron. Los resultados demostraron que la inserción de una capa adicional de las células del estroma por debajo de la monocapa CE aumentó significativamente la migración de las células hematopoyéticas hacia la SDF-1 (Figura 4). Este hallazgo es consistente con la noción de que el microambiente local contribuye a el reclutamiento de células en circulación para el tejido.

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Figura 1. El dispositivo de cámara de flujo 3D. A: El dispositivo 3D herméticamente sellado consta de dos compartimentos separados por una membrana porosa reemplazable (PM). CE se cultivan en la membrana, que entonces forma una barrera entre los compartimentos superior e inferior. Tensiones de cizallamiento definidos se aplican al compartimiento superior del dispositivo de 3D por medios de comunicación de perfusión utilizando una bomba de infusión peristáltica constante. Células circulantes son o no interactivos (NIC), interactuar con la CE de forma transitoria ('roll', RC), o de adherirse a la EC (AC). Una subpoblación de células adherentes transmigra a través de la capa de CE para el compartimiento inferior estática del dispositivo (TM) B:. Un dibujo vista superior (panel superior) del dispositivo de 3D. La vista en sección horizontal (panel inferior) muestra la posición de la membrana superior (rojo), la membrana inferior (verde), y la parte inferior del pozo (azul) C:. El isometrivista c ilustra las partes integrales del dispositivo: cuatro tornillos, un bloque de acrílico, un sello de la cámara superior, superior y membranas inferiores, parte inferior o-ring, ya 3 y poleas acrílico D:. Una fotografía del flujo 3D cámara conectada a una bomba peristáltica y una unidad de intercambio de gases. El sistema se ensambla en una campana estéril y luego se transfiere a una incubadora de cultivo celular.

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Figura 2. Una representación esquemática del sistema de dispositivo de 3D. El dibujo muestra las tres paradas necesarias para montar el sistema. El medio de cultivo se aspira desde la entrada por la presión negativa creada por la bomba peristáltica. El flujo del medio se apaga por parada # 1 para permitir que los insertos para ser colocados en el dispositivo. Después de que la cámara está cerrada, la bomba es switched de nuevo y la cámara se llena inmediatamente con medio para prevenir el secado de las células cultivadas en los insertos. Detener # 2 permite medio para ser colocado en la unidad de intercambio de gases. Detener # 3 permite el flujo a ser detenido para la conexión de la entrada y la salida. El caudal puede ser dirigido en una dirección hacia la derecha o hacia la izquierda para eliminar las burbujas de aire a través de la unidad de intercambio de gas mediante el uso de un interruptor en la bomba.

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Figura 3. El dispositivo 3D soporta la transmigración SDF-1-mediada de células progenitoras hematopoyéticas en condiciones de esfuerzo cortante fisiológico. A: Tres equipos (cada uno con 3 pozos en el compartimiento inferior) se reunieron y se ejecutan en paralelo. Medio solo o medio que contiene SDF-1 a 5 o 50 ng / ml se añadió a los pocillos compartimiento inferior. Murino bocélulas de la médula ne se les permitía circular en los dispositivos de 4 horas. A partir de entonces, cada dispositivo fue desmontado y las células que habían transmigrado hacia SDF-1 (amarillo) se obtuvieron de los pocillos inferiores, se contaron y se cultivaron en metilcelulosa suplementado con factores de crecimiento hematopoyéticos (GF). Catorce días más tarde, las colonias se puntuaron bajo el microscopio B:. El número de células progenitoras (células formadoras de colonias, CFC) recuperado de los compartimentos inferiores se muestran como la media ± SD de tres pocillos por condición. * P <0,05.

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La Figura 4. El efecto del microambiente en las interacciones entre las células hematopoyéticas y células endoteliales. A: La ilustración muestra la posición de una segunda membrana porosa con st cultafibroblastos romal (SF) por debajo de la membrana superior con EC. Otras abreviaturas son como se describen para la Figura 1A B:.. La membrana adicional (movible inferior) con SF cultivadas se insertan debajo de la membrana superior C: Tres equipos (cada uno con 3 pozos) se llevaron a cabo en paralelo. Medio solo o medio que contiene SDF-1 a 50 ng / ml de SDF-1 se añadió a los pocillos compartimiento inferior. Las cámaras de control negativo omiten SC, SDF-1, o ambos. Células de la médula ósea se permite la circulación durante 4 horas a 37 ° C. A partir de entonces, cada dispositivo fue desmontado y las células trasmigrados se obtuvieron de los pozos compartimiento inferior y se contó. El número de células transmigrados recuperados se muestra como la media ± SD de tres pozos por condición. * P <0,05.

Discusión

El dispositivo de 3D puede ser una tecnología útil para la investigación en varios campos, incluyendo la biología de células madre, la biología vascular, hematología, oncología, la autoinmunidad y la inflamación. El dispositivo 3D será particularmente útil para los investigadores que estudian las células hematopoyéticas, mesenquimales, neurales, y otra madre para investigar los mecanismos moleculares que regulan cada paso de la cascada de la extravasación de células madre. Los investigadores que estudian la migración de células también pueden utilizar este dispositivo para examinar los mecanismos migratorios diferentes de T y linfocitos B, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK, y otras células migratorias. En la biología vascular, el dispositivo será útil para evaluar el efecto del microambiente local, en la capacidad de CE para apoyar el reclutamiento de células y para imitar la barrera sangre-cerebro in vitro. Para los investigadores se centran en la patogénesis de la enfermedad, el dispositivo puede ser usado para estudiar la migración de las células T citotóxicas en el páncreas durante la diabetes de tipo I, la millasmigración de eosinófilos en los pulmones de los pacientes con asma, la migración de los neutrófilos, monocitos y linfocitos en los sitios de inflamación en una variedad de trastornos, el reclutamiento de células a sitios de la herida de curación, la interacción de las células T citotóxicas con la neovasculatura, y el reclutamiento de los linfocitos T citotóxicos en tumores.

El nuevo dispositivo 3D también será una herramienta útil para la ciencia traslacional y para el desarrollo de fármacos preclínicos y cribado. Por ejemplo, el dispositivo se puede utilizar para optimizar la preparación de suspensiones de células terapéuticas para la administración intravenosa, para poner a prueba el reclutamiento de células terapéuticas a los tejidos lesionados frente a los tejidos normales, y para examinar la función del órgano específico o tejido y el endotelio en este microambiente proceso. Para el desarrollo de fármacos, el dispositivo podría ser utilizado para probar los fármacos candidatos que las células tumorales diana y bloquear cada paso de la cascada de la extravasación, para poner a prueba las células que migran como un medicamento entregary vehículo a los sitios tumorales, para probar fármacos que regulan la función del endotelio específica de órgano humano o el microambiente del tejido local específica, y para poner a prueba las combinaciones de medicamentos que regulan los diferentes pasos de la cascada de recalada. Por último, cuando se convierte en un sistema de alto rendimiento, el dispositivo se puede utilizar para la detección de pequeñas moléculas, péptidos, anticuerpos y moléculas diana que median el tráfico de células.

Las características técnicas y consejos

Rodamiento y adhesión bajo flujo son los pasos críticos en la cascada de la extravasación y contribuyen de manera significativa a la eficiencia de la migración celular in vivo. Notablemente, estos pasos no contribuyen a ensayos estáticos in vitro. Sin embargo, los ensayos de transmigración estáticos son útiles como controles negativos en experimentos para probar los efectos de la tensión de cizallamiento en la supervivencia celular y la función, incluyendo la capacidad de CE para apoyar las interacciones de baja afinidad (de rodadura) y la adhesión firme.

La elección del medio para los experimentos en el dispositivo 3D es importante. Los medios de comunicación contienen diferentes factores de crecimiento que pueden influir en la supervivencia de las células circulantes, en particular durante tiempos de incubación largos. Además, las concentraciones de Ca2 + y Mg2 +, que pueden influir en las interacciones adhesivas en condiciones de flujo fisiológico, variar considerablemente en medios de cultivo comerciales. Otros detalles técnicos que deben tenerse en cuenta en la planificación de los experimentos con el dispositivo 3D se analizan a continuación.

Selección de la monocapa CE

La firma superficie de la célula de CE está influenciada por diversos parámetros, incluyendo las especies y tejidos de origen y las condiciones de cultivo celular, que deben tenerse en cuenta en el diseño experimental. Algunos EC comúnmente usados ​​incluyen pulmón derivado microvascular CE (LDMVEC), médula ósea derivada de EC (BMDEC), EC derivado del cerebro (BDEC) y HUVEC.Las propiedades de la CE también varían de acuerdo con su origen. Por ejemplo, BMDEC expresan constitutivamente selectinas y VCAM-1, que son responsables de rodadura y la adherencia, mientras que BDEC, LDMVEC, y HUVEC no expresan estas moléculas en condiciones normales. Por lo tanto, los insertos recubiertos con BDEC, LDMVEC, y HUVEC pueden tratarse previamente con TNF α (10 ng / ml, 4 horas) o de otros factores para imitar la inflamación y de inducir la expresión de moléculas mensajeras.

Prueba de diafonía con el microambiente local de

Existe un creciente interés en la comprensión de cómo el microambiente local, regula las funciones de la CE y participa en la extravasación celular. Nuestros resultados demuestran que la inserción de una monocapa de células del estroma por debajo de la monocapa CE aumenta de manera significativa la extravasación de las células circulantes. Este hallazgo demuestra que la diafonía entre CE y estroma mejora la capacidad de la CE para apoyar la extravasación de células circulantes. Moreoembargo, la inserción de células de diferentes microambientes (por ejemplo, células madre mesenquimales, fibroblastos de pulmón, células tumorales, astrocitos) podría ayudar a imitar lechos vasculares específicos. En particular, una combinación de CE y astrocitos derivado del cerebro podría ser un enfoque útil para imitar la barrera sangre-cerebro. Del mismo modo, las células obtenidas de pacientes, o de las células normales manipulados in vitro, podrían ayudar a imitar un microambiente enferma específica.

En nuestros estudios, hemos utilizado inserciones inferiores con células estromales cultivadas a 50% de confluencia. Aunque la densidad óptima de las células microambientales sobre los insertos dependerá de los objetivos del estudio, este puede ser fácilmente manipulados y controlados.

Selección de un tipo de esfuerzo cortante

La tensión de cizalla de 0,8 dinas / cm 2 se utiliza aquí porque esto ha sido demostrado por von Andrian et al. al ser la tensión de cizallamiento en el microvasculatur médula óseae, donde las células progenitoras hematopoyéticas salen de la circulación y entran en los tejidos en condiciones fisiológicas normales 15. En contraste, se observan niveles más altos de tensión de cizallamiento en los vasos más grandes, en los que la extravasación de células es limitado. Por lo tanto, las altas tasas de esfuerzo cortante podrían ser utilizados como controles adicionales para los experimentos que examinan la extravasación de diversos tipos de células.

La supervivencia de las células bajo esfuerzo de cizalla depende de varios factores, incluyendo el tipo de células y tratamientos de células ex vivo (Goncharova et al., Observaciones no publicadas), y por lo tanto debe ser evaluado cuidadosamente durante la prueba. Sensibilidad de las células a diferentes niveles de tensión de cizallamiento (resistencia a la tensión de cizallamiento) puede ser evaluado mediante la programación de la bomba peristáltica para aumentar la tasa de esfuerzo cortante incremental de 0,8 dyn / cm 2 al 6 dinas / cm 2. Durante estas pruebas, las células se pueden recoger periódicamente desde la cámara de intercambio de gas para controlar la muerte celular utilizando comodice como exclusión de azul tripán, anexina V y la tinción PI, y la expresión de marcadores de apoptosis.

Si los experimentos están diseñados para probar la resistencia a la tensión de cizallamiento de las células diseñadas ex vivo o células derivadas de parénquima, se recomienda que los controles positivos adicionales, tales como las células transmitidas por la sangre, se incluyen en los experimentos.

La selección del tamaño de poro de inserción y recubrimiento ECM

Inserta están disponibles con varios tamaños de poro (3, 5, y 8 micras). La elección del tamaño de poro dependerá del tamaño y las propiedades de las células de ensayo que circulan, que es también el caso para los ensayos Transwell estáticas. Se recomiendan plaquitas con un tamaño de poro grande (8 micras) para poner a prueba la extravasación de células grandes, tales como las células tumorales de origen epitelial. Los leucocitos o células madre hematopoyéticas se ponen a prueba con más frecuencia con 5 micras de poro insertos, insertos y 3 micras de poro son los más reservados para las pruebas de la extravasación de scélulas Menores. Sin embargo, el tamaño de la celda de prueba por sí sola no es el único factor importante y se recomienda probar insertos con varios tamaños de poro.

En nuestros estudios iniciales, hemos probado varios ECM por su capacidad para apoyar el crecimiento de la CE sobre los insertos y para soportar la tensión de cizallamiento durante> 4 horas. El ECM probadas incluyeron Matrigel, poli-D-lisina, fibronectina, laminina, colágeno de tipo I, de hidrogel, Meta-queratina I, II, III, IV, y extracelular. Los mejores resultados para el crecimiento de CE se obtuvieron con extracelular, fibronectina, y colágeno. Sin embargo, en nuestras manos, extracelular en el 0,8 g / cm 2 redujo significativamente la transmigración de las células de ensayo a través de la membrana. Por lo tanto, ahora utilizamos la fibronectina (5 mg / cm 2) o colágeno (5 mg / cm 2) para el recubrimiento de las inserciones. Sin embargo, la elección óptima de ECM probablemente estará influenciada tanto por el tipo de CE y las propiedades transmigratorios de las células de ensayo. Un experimento preliminar se debe realizar para probar la integrity de la monocapa CE cultiva en ECM seleccionado. Por ejemplo, colocar insertos pre-recubiertos con CE monocapas en placas de Petri llenas de medio de cultivo, coloque los platos en un agitador para crear tensión de corte (nivel bajo), y se incuba a 37 ° C y CO 2 durante 12 horas el 5%. La integridad de la CE después de la exposición a la tensión de cizallamiento puede ser evaluada mediante la tinción de cristal violeta.

La selección de las concentraciones de células de ensayo óptimas

La capacidad de las células de ensayo para salir de la circulación depende de muchas características específicas de cada tipo de célula. Para generar resultados estadísticamente significativos, la densidad de las células circulantes se debe optimizar para asegurar que un número suficiente de células migran en los pocillos de control positivo. Por lo tanto, se recomienda la realización de pruebas iniciales con una gama de densidades de células (por ejemplo, 10 3 / ml a 10 7 / ml) para comprender la relación entre el número de células de carga en el sistema yel número de células que se someten a la transmigración.

Además, la concentración óptima circulante puede diferir para el mismo tipo de células obtenido a partir de diferentes fuentes. Por ejemplo, las células CD34 + son una población heterogénea de células que contiene tanto células madre hematopoyéticas y progenitores comprometidos específicos de linaje. Se pueden obtener de la médula ósea, sangre periférica movilizada, y sangre del cordón umbilical. Las células CD34 + derivadas de estas tres fuentes poseen diferentes capacidades mensajeras y el injerto 16-18, por lo que las condiciones para las pruebas de estas células en el dispositivo 3D deben ser optimizados antes de un estudio a gran escala.

Selección de óptima el tiempo de circulación de células

El tiempo óptimo de circulación debe ser determinada empíricamente para cada tipo de célula. El tiempo mínimo requerido para la circulación podría extrapolarse a partir de los resultados de los ensayos de migración estáticas, pero esto puede ser eXtended cuando las células se someten a tensión de cizallamiento. Se recomienda realizar estudios piloto de pruebas de tiempos de circulación entre 4 y 96 horas.

La unidad de intercambio de gases

El propósito principal de la unidad de intercambio de gases es mantener la concentración óptima de CO 2 en el medio circula a través del dispositivo de 3D, similar a la configuración en incubadoras de cultivo de tejidos estándar. La unidad de intercambio de gas también se puede utilizar para la adición de células de ensayo y los compuestos y para la recogida de las sondas y de las muestras durante la prueba.

Evaluación del número de células de ensayo

Células circulantes pueden ser muestreados a diferentes tiempos durante el experimento a través de la unidad de intercambio de gases. Al final del experimento, las células restantes en la circulación podrían ser recogidos de la toma. Cuando el dispositivo 3D se desmonta al final del experimento, las células trasmigrados pueden ser cosechadas a partir de los pocillos inferiores y se recogen fo su posterior análisis. Si las celdas de entrada están sin etiqueta, las células transmigrados se pueden teñir con azul de tripano y células vivas / muertas enumerados microscópicamente. Alternativamente, las células de entrada podrían ser etiquetados con uno de los muchos colorantes "celular del perseguidor" disponibles para imágenes de células vivas antes de la carga en el dispositivo de 3D, en este caso, la cosechada transmigró células deben ser lisadas para la cuantificación de la fluorescencia.

La selección del tamaño óptimo de la muestra

Para permitir el análisis estadístico, el tamaño de la muestra se debe seleccionar que proporcionará aproximadamente el 80% de potencia para detectar la diferencia hipotética de las variaciones porcentuales medias entre dos grupos cuando se analizaron en un nivel de significación de 0,05 mediante una prueba t de dos lados. Basándonos en nuestra experiencia con células de médula ósea, se utilizan tres pocillos por condición experimental para los experimentos de dispositivos 3D. Sin embargo, el tamaño de muestra óptimo variará con el objetivo del experimento y debe ser determinada empirically. Varias pruebas de regresión estadística, dos caras t-test y análisis de varianza se pueden utilizar para verificar la relevancia estadística de los resultados.

Selección de quimiocinas

Como para todos los ensayos de transmigración, la elección de quimioatrayente será dictada por las propiedades de las células de ensayo y el objetivo del estudio. SDF-1 es un quimioatrayente bien establecido para las células hematopoyéticas. En nuestras manos, una concentración de 50 ng / ml de SDF-1 era óptima para estimular la extravasación de células óseas progenitoras hematopoyéticas derivadas de médula. También utilizamos C3a y bFGF como quimiotácticos para las células madre mesenquimales 19. Sin embargo, recomendamos titulando cada uno de quimioquinas y transversal de valoración combinaciones de quimioquinas para identificar el intervalo óptimo de concentración antes de un estudio a gran escala. Para ciertos tipos de células, una combinación de factores quimiotácticos puede ser beneficioso. Si quimiocinas de células de ensayo específicos son desconocidos o no está disponible, CONmedios condicionados de linfocitos estimulados, los fibroblastos y otras células pueden ser utilizados como una fuente de quimioatrayentes.

La selección de los parámetros de lectura

La versatilidad del dispositivo 3D se ampliará el tipo de experimentos de transmigración que se pueden realizar, y el éxito de los experimentos dependerá de una consideración cuidadosa y el diseño de los parámetros de lectura. Como regla general, las células recogidas del compartimento superior (en circulación) y el compartimiento inferior (estática) deben ser probados para la viabilidad en el mismo tiempo que el recuento de células. Algunas células tienen baja tolerancia a la tensión de corte fisiológico observado en la microvasculatura. En este caso, el número de células muertas se incrementará en el compartimiento superior. El número de células adherentes detenidos (o atrapado) en la capa de CE puede ser evaluado por la inmunocitoquímica de los marcadores expresados ​​específicamente por las células de ensayo. Los anticuerpos específicos para CD31 y vWF se pueden utilizarpara detectar la CE y para permitir la discriminación entre las células de ensayo y la CE. Además, la integridad de la monocapa CE debe monitorizarse al final de cada prueba.

Los tipos de análisis realizados con las células recogidas dependerán de los objetivos experimentales de los investigadores, pero podrían incluir el análisis de los cambios en la expresión génica por microarrays y qPCR, expresión de moléculas de superficie por análisis FACS, la activación de vías de señalización por FACS y Western Blot, y el factor de la secreción por ELISA. Una enorme variedad de pruebas funcionales son posibles sobre las células recogidas in vitro, como lo demuestra nuestro propio trabajo en el que cultivamos las células de médula ósea transmigrados para enumerar las células progenitoras hematopoyéticas (Figura 3). Las muestras recogidas también podrían ser probados en una variedad de ensayos in vivo.

Un parámetro importante que puede ayudar a predecir el comportamiento de las células de ensayo in vivo es la tiendenrencia de algunas células a formar agregados bajo diferentes tasas de esfuerzo de cizallamiento. Por ejemplo, las células terapéuticas que se someten a la formación de agregados en el dispositivo de 3D ​​pueden tener una mayor tendencia a formar grumos después de la administración intravenosa y causar obstrucción vascular aguda in vivo (Goncharova et al., Observaciones no publicadas). La formación de agregados puede ser monitoreado microscópicamente mediante el muestreo de las células de ensayo durante o después de la finalización del experimento dispositivo 3D.

Divulgaciones

Cascade LifeSciences Inc. posee los derechos exclusivos de patente de EE.UU. N º 7.927.867 B2 "Dispositivo de evaluación en la migración celular in vitro en condiciones de flujo y métodos para el uso de los mismos". SKK es un inventor de la tecnología de dispositivos de cámara de flujo en 3D y un co-fundador científica y accionista de Cascade Life Sciences Inc.

Agradecimientos

Agradecemos a Chuck Scott y Victor McKnight de la CBS Scientific Company Inc. ( www.cbsscientific.com ) para asistencia de ingeniería y fabricación de la cámara 3D, la unidad de intercambio de gases, y se inserta. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones R21DK067084 y R43CA141782 para SKK).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo/Material
PVC fuerte (diámetro 1,42, pared 0,8)Watson-Marlow Limitid981.0142.000
Cámara 3DC.B.S.ScientificFC-1000
Unidad de intercambio de gasesC.B.S.ScientificFCR-1000
InsertosC.B.S.ScientificFCI-1005U
Colágeno Bovino, Tipo IBD Biosciences354231
Ácido clorhídrico 0.1MVWRBDH3200-1
PBS Invitrogen14190
HUVECLonzaCC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)LonzaCC - 3124
Solución neutralizante de tripsinaLonzaCC-5002
TripsinaLonzaCC-5012
HEPESLonzaCC-5024
SDF-1R7D System460-SD
Extracel Trial 2.5 KitGlycosam ByosystemsGS211
Fibronectina, humano, naturalezaBD Biosciences356008
Poly-D-lisinaMilliporeA-003-E
BD MatrigelBD Biosciences354277
Cerebro humano Células endoteliales microvascularesScienCell1000
Célula endotelial Medio (ECM) para células cerebralesScienCell1001
Trypan BlueStemCells Tecnologies7050
TNF-alfa, 10 μ gInvitrogenPHC3015
VCAM-1, ratón antihumano, CD106-FITCSouthern Bioteck9519-02
Solución de tinción de yoduro de propidioBD Pharmingen# 556463
Sangre de cordón umbilical humana congelada CD34+ célulasStemCellCB007F
Sangre de cordón umbilical humana congelada CD34+células ZenbioSER - CD34-F
MethoCult GF M3434StemCells TecnologiesGFM3434
Ratón Metilcelulosa medios completosR& DHSC007
Anti-Von Willibrand Anticuerpo FactorabcamC# ab11713
Placa de Petry (35 x 10 mm)VWRCA25373-041
Tubos de 15 mlVWR Fisher21008 - 918
Matraces para cultivo de tejidos 75cm2VWR
Violeta cristalSigmaC-3886-25G
Pinza de disección, curvadaVWR82027-384
1.000 μ l Puntas de pipetaVWR83007-380
1 - 200 μ l Puntas de pipetaVWR37001-530
Equipment
Bomba peristálticaWatson-Marlow Limitid403U/VM3
BD353136

Referencias

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