Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

La función exacta de exosomas que circulan permaneció desconocido durante un largo período de tiempo. Incluso ahora el mecanismo de ruta completa de exosomas no se entiende completamente. Desde exosomas llevan principalmente se ha dado prioridad antígenos, proteínas y ARN (ARNm y miRNA) que los relaciona con su celular de sus padres de origen, su función como transmisores de señalización célula-célula.

Muchos métodos diferentes se han descrito en la literatura para el aislamiento y la detección cuantitativa de exosomas ^1,2. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre un "patrón oro". Mientras tanto, la mayoría de los científicos que trabajan en el campo de la investigación exosome de acuerdo en que un método consistente de aislamiento es muy justificada para lograr un mayor grado de comparabilidad entre los distintos informes y estudios.

Fluorescencia clasificación de células activadas (FACS) es la herramienta más común y frecuente para el análisis exosome ^3. FACS tiene el benbenefi- que, a través de etiquetado de fluorescencia, las células de diferentes orígenes se pueden comparar en un solo paso. Las principales desventajas de FACS son que este método no es lo suficientemente sensible para identificar las partículas menores de 0,5 micras ^4, mientras que los exosomas son generalmente entre 30-120 nm de diámetro ^5, menos aún para medir su tamaño.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) son otras herramientas para el análisis de tamaño de partícula y la morfología de los exosomas. Sin embargo, tanto SEM y TEM tienen la desventaja de que la preparación de muestras consume mucho tiempo, ambos métodos implican pasos de trabajo intensivo y cada uno tiene un cierto riesgo de generación de artefactos. Ningún método es adecuado para la gran cantidad de muestras y caracterización de varios miles de partículas individuales de una muestra. Por otra parte, un análisis cuantitativo para la rutina diaria clínica donde las muestras tienen a menudo para ser analizada de manera simultánea o al menos en un período muy corto sedifícil de realizar. Técnicas de nueva generación ahora nos permiten analizar exosomas sin un intenso trabajo preparatorio previo (SEM por ejemplo, ambientales). Estas técnicas modernas son aún bastante incómodo para el análisis de grandes volúmenes de suspensiones que contienen los exosomas para determinar su promedio y distribución de tamaño ^6.

Otro método muy sensible para la visualización y análisis de los exosomas es el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA). Este método se aprovecha de dos principios diferentes de la física. En primer lugar, las partículas son detectados por la luz dispersada cuando se irradian con un rayo láser. El segundo fenómeno se conoce como movimiento browniano, según la cual la difusión de diferentes partículas en una suspensión líquida es inversamente proporcional a su tamaño. En el último caso, el movimiento también depende de la temperatura y la viscosidad del líquido. Sin embargo, esta tasa está directamente relacionado con el tamaño de partícula y es utilizado por NTA. Utilizando suaveanálisis basado en cerámica, se graban las imágenes digitales de la luz dispersada de partículas individuales. Parcelas de puntos de luz repartidos y su velocidad de movimiento proporcionan los datos que facilite la determinación del recuento de partículas totales y distribución de tamaños. Esta técnica es particularmente potente para el análisis de partículas con un diámetro medio de menos de 100 nm.

Las mediciones de tamaño y la concentración se realizan con el ZetaView browniano y análisis de electroforesis de vídeo con movimiento microscopio. Este es un servicio de la parte superior de nanopartículas análisis instrumento semi-automatizado para muestras líquidas (en adelante, el instrumento de seguimiento de partículas). Consiste en el analizador de rastreo de partículas, así como un ordenador portátil con el software utilizado para el análisis de datos. Muestras biológicas heterogéneos son los adecuados para este método en forma de suspensiones más homogénea de partículas inorgánicas. Un microscopio de dispersión de láser con una cámara de vídeo se utiliza para la detección de partículas y para la OBSErvación de su movimiento. Mientras que el eje microscopio es horizontal y centrado en el canal de celda llena con una suspensión que contiene los exosomas, el haz de láser está orientado verticalmente. Las partículas irradiadas por la dispersión de la luz láser, que se contabilizan en 90 ° por una cámara de vídeo digital a través del microscopio (Figura 1). La intensidad de la luz dispersada permite la observación de partículas mayores de 60 nm de diámetro. En tal escenario el brillo de una partícula no es la única indicación de tamaño de partícula. Cuando no se aplica campo eléctrico, el movimiento de partículas sólo sigue el movimiento browniano y puede servir como un indicador para el cálculo de tamaño de partícula. Sin embargo, el instrumento también es capaz de aplicar un campo eléctrico a través del canal de la célula. Cuando se somete a este campo, el potencial, la polaridad y el nivel de iónicos cargo de los exosomas suspendidos vuelven más determinantes de la dirección de su movimiento. La velocidad y la dirección resultado en un mo electroforéticahistograma bilidad.

Mientras que encontrar un método óptimo para analizar exosomas aisladas es un problema, otro radica en el aislamiento eficaz de los exosomas de diferentes medios de comunicación, tales como la sangre, ascitis, orina, leche, líquido amniótico o medios de comunicación celular. Diferentes métodos han sido descritos hasta ahora, que se basa en la ultracentrifugación ^1, reactivos de separación industriales (tales como Exoquick) ^7, perlas magnéticas para el antígeno empleando separación ⁸ o ultrafiltración ⁹ pasos.

En este protocolo se demuestra todo el proceso de aislamiento exosome mediante ultracentrifugación y mostramos cómo analizar la exosome resultante que contiene la suspensión a través del instrumento de seguimiento de partículas. Se proporcionan consideraciones específicas para el análisis de un medio de plasma o cultivo de células humanas exosomas derivados.

NOTA: Los experimentos presentados en este trabajo han sido aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad de Düsseldorf.

1. Preparación exosome

1. Recoger la sangre entera en 3 tubos de citrato mediante venopunción (total de 9 ml). Verter la sangre en un tubo Falcon de 15 ml.
2. Centrifugar la muestra a 1500 xg durante 20 min a 4 ° C para iniciar la separación de las células del plasma. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon de 15 ml.
3. Centrifugar la muestra a 2800 xg durante 20 min a 4 ° C para eliminar todas las células del plasma (plasma libre de células; PPC). Transferir el PPC para tubos de ultracentrifugación, 1 ml al tubo.
4. Centrifugar a 100.000 xg durante 90 min a 4 ° C para agotar exosomas. Eliminar 900 l de sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento en los 100 l restantes en el tubo de ultracentrifugación. Añadir 900 l de PBS.
5. Centrifugar de nuevo a 100.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Quite 900 l de supernatant. Vuelva a suspender el sedimento con los 100 l restantes.
6. Transferencia de 5 a 20 l de resuspensión en 40 ml de agua destilada. Se filtra la suspensión a través de un filtro de 450 nm para separar exosomas de partículas más grandes. Utilice esta suspensión final para la medida de la partícula.

2. Procedimiento de inicio del Instrumento de Rastreo de Partículas

1. Inicie el programa haciendo doble clic en el icono del software. Haga clic en las distintas fichas de software ("Check Cell", "Medición", "Análisis") para cambiar entre ellos durante todo el protocolo.
2. Siga las instrucciones de la pantalla para una aplicación automática del procedimiento de arranque. Seleccione las casillas de verificación de calidad, tanto para celular y alineamiento automático.
   NOTA: Cualquiera de estos pasos se puede repetir por separado si es necesario mediante el botón (A) o (B) pulsando en la pestaña de "cheque en la celda".
3. Abra la entrada y la abertura de salida del instrumento NTA e inyectar 10 ml de agua destilada por la jeringa en el canal de la célula a través del puerto de entrada. Cierre el orificio de salida a medida que se inyecta la última cantidad de agua. Coloque un vaso debajo del orificio de salida para recoger solución residual. Asegúrese de que la célula de medición está libre de burbujas de aire y no jeringa burbujas de aire en el sistema. Cierre la puerta de entrada de inmediato.
4. Lleve a cabo el control de calidad celda haciendo clic en "Aceptar". El software mostrará los resultados de calidad de células después de unos segundos.
5. Si las partículas todavía se visualizan en la pantalla de una imagen en directo del software o si el resultado de la comprobación de calidad sólo es buena o mala, repita el paso 2.3 hasta que las partículas restantes se retiran de la célula de medición. También repite el paso 2.3 después de cada medición para evitar la acumulación de partículas. Si la repetición de la inyección de agua destilada y verificación celular no produce un "buen" resultado, proceda a 2,9.
6. Preparar una suspensión de control que contiene uniforme 200 pol tamaño nmystyrene partículas que se utilizan para alinear los focos del láser y microscopio. Añadir una gota de la suspensión concentrada, proporcionado por el fabricante del instrumento, a 500 ml de agua destilada para obtener la concentración requerida de manera que 600 ± 100 partículas se muestran por pantalla en la vista en vivo.
7. Inyectar la suspensión de alineación en el instrumento NTA como se describe en el paso 2.3. Pulse el botón "OK" para iniciar la alineación automática, una rutina automatizada a través del cual el sistema buscará automáticamente la posición óptima de los dos focos.
8. Ahora, cuando aparece un mensaje que indica el sistema está listo para los experimentos, haga clic en Aceptar para iniciar la medición.
9. Ocasionalmente, limpiar el canal de la célula manualmente entre los experimentos mediante el lavado de la célula con una solución al 30% de etanol. Limpie el canal cada vez que el software muestra un informe de errores automático.

3. Medición de la Muestra

1. Enjuague el canal con agua destilada antes de la EAmedición de la muestra ch (como se describe en el paso 2.3).
2. Inyectar la suspensión exosome (preparado en el apartado 1) en el canal, tal como se describe en el paso 2.3.
3. Ajuste los siguientes parámetros principales en el software según sea necesario:
   1. Sensibilidad. Con el fin de encontrar el rango de sensibilidad óptima, haga clic en el botón "número de partículas vs. sensibilidad" para mostrar una curva de partículas medidas por pantalla para diferentes niveles de sensibilidad. Elija un nivel de sensibilidad antes de la pendiente máxima de la curva. Un nivel mayor sensibilidad permite la visualización de las partículas más pequeñas, pero también aumenta las cuestiones relacionadas con el ruido de fondo.
   2. Brillo mínimo. Elija un brillo inicial de 20 para la medición exosome utilizar esta función como un filtro. Regule este parámetro hasta en blanco fuera fuertemente partículas de dispersión de luz. Regular hacia abajo para amplificar débilmente dispersión de artefactos. Variar el brillo según sea necesario durante todo el experimento.
      NOTA: Las partículas que luz-Scatter superponerse demasiado fuerte y puede ser excluido del análisis por error.
   3. Min y Max Size. Establecer un filtro digital para eliminar el ruido de píxeles y la dispersión no deseada de partículas de gran tamaño mediante la regulación del tamaño mínimo y máximo. Utilice un rango de 10 a 500 píxeles para la medición de los exosomas.
   4. Shutter. Ajuste el período de tiempo que la cámara está abierto a 1/300 seg.
4. Vive parámetros leídos:
   1. Cambiar entre una cámara digital y una vista operandi análogo en cualquier momento haciendo clic en el botón "Live-imagen".
   2. Durante todo el experimento, supervisar la barra de intensidad de dispersión, que muestra el estado de saturación de la muestra como un indicador de color codificado. No analizar exosomas si la barra de dispersión es de color rojo. En tal caso diluir aún más la muestra para evitar este fenómeno. Si la condición experimental prohíbe que una manipulación de la suspensión de la muestra, regular a la baja la sensibilidad o hasta de regular el brillo en el software-sjustes para mejorar los resultados de la medición.
      NOTA: Cuando se analizan muestras con una muy alta concentración de partículas de la dispersión se fundirá partículas individuales y ellos se cuentan como una sola partícula.
   3. Tenga en cuenta el número de partículas contadas en el campo de visión de la pantalla.
5. Haga clic en la pestaña "valoración".
6. Seleccione los ajustes en el "opciones de ejecución" matriz.
   1. Antes de cada adquisición, seleccione "movimiento de verificación 'para una prueba de la deriva de partículas de verificación repetida. Realice la prueba al menos una vez antes de iniciar todo el análisis. Si la desviación es superior a 20 m / seg, esperar antes de continuar la medición de manera que la muestra deja de fluir.
   2. Seleccionar el número de experimentos (5) y el retardo de tiempo entre ellos (0).
   3. Realizar un "control de la muestra 'si es necesario. Esta prueba es parte de la alineación automática en el procedimiento de puesta en marcha y se puede repetir después como sea necesario.
   4. Por último, haga clic en el botón "adquisición de vídeo ejecutar". En la nueva ventana, definir el número de ciclos (15) y el número de posiciones de medición (11).
      Nota: El cabezal láser y el microscopio se puede mover a analizar el número de partículas en 11 posiciones diferentes. Dependiendo de la demanda experimental, debe decidir si el experimento se debe realizar en una sola posición o en diferentes posiciones.
      1. Confirme la duración mínima vez que una partícula tiene que ser rastreado a ser contado como uno partícula individual mediante el establecimiento de la resolución de vídeo (bajo). A los resultados de menor resolución en una duración de seguimiento más corto.
      2. Seleccione un nombre de archivo y haga clic en "Aceptar" para iniciar la medición.

   4. Interpretación de los resultados

   1. Ver los siguientes resultados y los parámetros que se muestran después de la medición en la pestaña "resultados": (1) el número total de partículas trazadas, (2) Número medio de una parteicles por posición, y (3) la concentración de partículas.
      1. Ver la tabla promedio de resultado para la relación numérica del tamaño de partícula (diámetro, superficie y volumen) para el porcentaje de números de partículas, así como los valores de la media y la diferenciación estándar.
      2. Utilice la tabla de análisis de picos si existe más de un pico en el análisis gráfico. Esta tabla muestra la distribución de partículas que son más pequeñas que el primer o segundo pico respectivamente.
   2. Ver el gráfico calculado después de la medición para ver una distribución de partículas por tamaño. Utilice los iconos en el modo de pantalla y por encima de la gráfica para cambiar la configuración.

La muestra utilizada para esta demostración muestra una configuración óptima para la medición con una sensibilidad del 85%, antes de la pendiente máxima de la curva de sensibilidad (Figura 2). El brillo, el min / se eligieron los valores máximos como se recomienda en el protocolo. Una concentración de 5,3 partículas / ml x 10 6 se midió, mientras que el tamaño medio de las partículas era de 0,149 m, ​​la mayoría de ellos eran 0.137 micras.

Los valores recibidos después de la medición se pueden guardar en un informe con un formato de archivo .pdf o como un archivo .txt para exportar a una base de datos. En el gráfico se puede ajustar según su preferencia, como se describe en el protocolo (sección 4). La secuencia de vídeo también se guarda y se puede utilizar para más tarde fuera de línea re-análisis. Sin embargo, en este análisis fuera de línea, los ajustes anteriores a la adquisición de la cámara no se pueden cambiar de forma retrospectiva.

Con el fin de encontrar los ajustes óptimos de los parámetros de una medición, que aquí describimos ªe optimización de los parámetros del instrumento en el ejemplo de un tamaño estándar de poliestireno de 100 nm. La influencia de los dos parámetros, la sensibilidad y min / tamaño máximo en la imagen de vídeo y la distribución de tamaño de partícula se discute en detalle. Todos los demás parámetros se resumen en la Tabla 1.

Una impresión visual del impacto de la sensibilidad (que varía de 50 a 94) en las imágenes analógicas y digitales se visualiza en la Figura 3. La información cuantitativa derivada de las imágenes se presenta en la Figura 4, basándose en los ajustes de la Tabla 1, Min = Tamaño 5 Tamaño y Max = 200. Una relación típica del número de partículas detectadas vs. sensibilidad se muestra en la Figura 4A. Entre 50 y 90, el número de partículas detectadas aumentó con la sensibilidad y aumentó dramáticamente por las sensibilidades> 90. Se encontró un intervalo óptimo de sensibilidad entre 66 y 86 (A). Distribuciones de tamaño de partículas obtenidas con el DIFAjustes de sensibilidad ferente se muestran en la Figura 4B. Las distribuciones de tamaño de partícula representan la media de tres mediciones individuales. Durante demasiado baja sensibilidad (sensibilidad = 62, curva roja) sólo se analizaron unas pocas partículas resultantes en las estadísticas bastante pobres. El número de partículas analizadas aumentó con la sensibilidad y alcanza un óptimo entre 70 (curva amarilla) y 86 (curva de bronceado). Aumentando aún más el liderazgo de sensibilidad a un deterioro de la distribución del tamaño de partícula con el número de partículas que caen y distribución del tamaño de desplazamiento hacia tamaños más pequeños (sensibilidad = 94, curva azul). Figura 4C muestra la tendencia del diámetro x50 basado en el número (50% de partículas son más pequeñas que este diámetro) como una función de la sensibilidad. En el intervalo beige, la RSD de tamaño de partícula fue de menos de 8% y corresponde al intervalo óptimo en A. Las regiones rojas indican RSD> 8% como resultado de las estadísticas pobres (sensibilidad demasiado baja) o amplia distribuciones con cambio a tamaños más pequeños (sensibilidad demasiado alta).

Los ajustes de tamaño mínimo y máximo tamaño son los filtros aplicados a las imágenes digitales con el fin de eliminar las partículas con tamaños de punto más pequeños que Min Tamaño y mayores de Max Size. Debido a la capacidad para dispersar la luz, una partícula crea un punto de un cierto tamaño en una imagen digital. El tamaño de la mancha se mide como un número de píxeles (px). Cuando una partícula dispersa la luz muy bien (por ejemplo, partículas> 200 nm o agregados), el tamaño del punto es bastante grande, por ejemplo,> 500 px. El tamaño del punto es bastante pequeña (por ejemplo, <10 px) para partículas pequeñas (por ejemplo, <20 nm) en función del material de partículas. Tamaño de punto (px) no puede intercambiarse con tamaño de partícula (nm), ya que no son idénticos y no hay relación directa entre estas dos variables. Una optimización de Min y Max Tamaño permite al usuario filtrar los objetos no deseados tales como aglomerados (Max Size) o pequeñaobjetos tales como el ruido de fondo (Min Tamaño). La influencia de Tamaño Min / Max en la distribución del tamaño de partículas de un tamaño estándar de 100 nm se muestra en la Figura 4D (sensibilidad = 82). Cuando el intervalo se establece en pequeños tamaños de punto (por ejemplo, min = 1, max = 52; curva naranja), el número de partículas analizadas se reduce y el diámetro x50 basada número se desplaza ligeramente hacia tamaños más pequeños. Un ajuste para los puntos más grandes (min = 40, max = 1,000; curva roja) resulta en una amplia distribución de tamaño de partícula desplazado hacia tamaños más grandes. A fin de obtener la igualdad de número total de partículas, los límites de intervalo de distribuciones tanto naranja y rojo se ajustaron para que coincida con 80 partículas. La distribución de los ajustes óptimos (min = 5, max = 200; curva tan) consta de 360 ​​partículas.

Una serie de experimentos exitosos se realizaron con exosomas aisladas por ultracentrifugación y medidos por NTA utilizando el sistema presentado. Los datos resultantes fueron altamenteconsistente y confirmado un alto nivel de reproducibilidad. Otros métodos de aislamiento deben mostrar resultados similares. Sin embargo, el paso de dilución fue identificado como un paso particularmente crítico y su impacto en las cifras totales calculadas de partículas tiene que ser re-evaluado.

Figura 1. Esquema de la configuración de la NAT. El / eje de vídeo microscopio y el rayo láser están orientados ortogonalmente entre sí, se cruzan en la sección transversal del canal de la célula. La luz dispersada por las partículas se muestra en la ventana "Live View" del software. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Impacto de la sensibilidad en analógico y digital de imágenes. La visualización de las partículas en la pantalla de visualización en vivo se muestra para sensibilidades entre 50 y 94 por tanto analógicas (fila superior) und digitales (fila inferior) vistas. Cuando la sensibilidad es demasiado baja, se detectan sólo unas pocas partículas (a la izquierda). En una sensibilidad óptima las partículas aparecen como puntos individuales bien aisladas una de la otra (en el centro). En un comparativamente altos partículas sensibilidad fusionan dando lugar a mala calidad de imagen (a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Influencia de sensibilidad min y ajustes de tamaño máximo para una muestra de control de partículas de poliestireno de 100 nm (A) Parcela de sensibilidad frente al número de partículas detectadas.; el intervalo óptimo es 66-86, antes de la pendiente máxima de la curva. Distribuciones (B) Tamaño de las partículas obtenidas con varios ajustes de sensibilidad (62-94); gráficos para demasiado baja (62) o demasiado alto (94) de sensibilidad no captan la distribución del tamaño de partículas para la muestra de control de poliestireno 100 nm. (C) Número basada diámetro x50 frente a la sensibilidad; el error de x50 en el intervalo de color beige es inferior al 8%, el intervalo óptimo es de 66 a 86. (D) Impacto de Min y Max Tamaño de la distribución de tamaño de partícula; parámetros óptimos (min = 5 y max = 200) capturan la correcta distribución de la muestra de control. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Resumen de los parámetros anteriores y posteriores a la adquisición de ajuste del instrumento de seguimiento de partículas.

Este trabajo fue apoyado por los fondos institucionales del Departamento de Cirugía Cardiovascular, Facultad de Medicina, HHU. Los costos de publicación de este estudio fueron proporcionados por Particle MetrixGmbH.