Recolección e identificación de helmintos de la vida silvestre

Resumen

Los animales salvajes suelen ser parasitados por una amplia gama de helmintos. Los cuatro tipos principales de helmintos son los "gusanos redondos" (nematodos), los "gusanos de cabeza espinosa" (acantocéfalos), los "trematodos" y las "tenias" (cestodos). Aquí describimos cómo se recolectan los helmintos de un animal vertebrado y cómo se conservan e identifican taxonómicamente.

Resumen

Los animales salvajes suelen ser parasitados por una amplia gama de helmintos. Los cuatro tipos principales de helmintos son los "gusanos redondos" (nematodos), los "gusanos de cabeza espinosa" (acantocéfalos), los "trematodos" y las "tenias" (cestodos). El método óptimo para recolectar helmintos es examinar un huésped que haya estado muerto menos de 4-6 horas, ya que la mayoría de los helmintos aún estarán vivos. Se debe realizar una necropsia exhaustiva y examinar todos los órganos principales. Los órganos se lavan en un tamiz de 106 μm con agua corriente y se examina el contenido con un microscopio estereoscópico. Se cuentan todos los helmintos y se fija un número representativo (ya sea en etanol al 70%, formalina tamponada al 10% o ácido alcohol-formalina-acético). Para la identificación de especies, los helmintos se eliminan en lactofenol (nematodos y pequeños acantocéfalos) o se tiñen (trematodos, cestodos y acantocéfalos grandes) utilizando hematoxilina de Harris o carmín de Semichon. Los helmintos se identifican con las especies mediante el examen de diferentes estructuras (por ejemplo, las espículas masculinas en los nematodos o el rostelo en los cestodos). Los protocolos aquí descritos se pueden aplicar a cualquier animal vertebrado. Requieren cierta experiencia para reconocer los diferentes órganos y ser capaces de diferenciar los helmintos de otros restos de tejidos o contenidos intestinales. La recolección, la conservación y la tinción son técnicas sencillas que requieren un mínimo de equipos y reactivos. La identificación taxonómica, especialmente de las especies, puede llevar mucho tiempo y puede requerir la presentación de especímenes a un experto o un análisis de ADN.

Introducción

Los vertebrados son parasitados por cuatro grupos principales de helmintos (gusanos). Dos de los grupos, los trematodos, o trematodos, y los cestodos, o tenias, pertenecen al filo Platyhelminthes. Los otros dos grupos son los nematodos, o gusanos redondos, (Nematoda) y los acantocéfalos, o gusanos de cabeza espinosa (Acanthocephala). Muchos de estos parásitos han sido documentados como causas de morbilidad y mortalidad en aves y mamíferos silvestres^1,2.

La mayoría de los helmintos tienen ciclos de vida complejos que involucran a más de un huésped^1,2 . Por ejemplo, los trematodos tienen uno o dos huéspedes intermedios (generalmente invertebrados) y un huésped final. Todos los huéspedes deben estar disponibles para que se complete el ciclo y, por lo tanto, para que los helmintos adultos estén presentes en los huéspedes finales (que son el tema de este manuscrito). Por lo tanto, es importante tener en cuenta que pueden ocurrir fluctuaciones estacionales en la prevalencia e intensidad de algunas especies de helmintos y es deseable un monitoreo a largo plazo para capturar el helminto completo de auna de un huésped en particular.

El método óptimo para recolectar helmintos es examinar un huésped que ha sido sacrificado. Esto permite la recolección de helmintos mientras aún están vivos y su correcta relajación y fijación. El material de los huéspedes que han estado muertos más de 24 horas, o que han sido congelados y descongelados para su examen, es a menudo inferior y difícil de identificar. Los trematodos y cestodos de huéspedes congelados o formalizinizados a menudo están mal contraídos y han perdido estructuras cruciales para la identificación, como las espinas orales de los trematodos o los ganchos del escólex de las tenias. Sin embargo, la realidad es que la mayor parte del material disponible de los huéspedes vertebrados en estos días está congelado o conservado.

Las bases de datos que contienen información sobre la secuencia de ADN de los helmintos están creciendo rápidamente y, por lo tanto, la identificación taxonómica ya es posible para muchas especies. Por lo tanto, los helmintos deben preservarse para posibles análisis de ADN tanto como sea posible. Sin embargo, el ADN de buena calidad no es posible si los especímenes están fijados en formol. Los métodos descritos aquí para recolectar y matar helmintos producirán material adecuado para la extracción de ADN y los análisis genéticos.

A continuación, describimos métodos detallados sobre cómo necropsiar vertebrados (anfibios, reptiles, aves y mamíferos; no se incluyen los trematodos monogéneos de peces) para la recolección de helmintos, seguidos de procedimientos sobre cómo preservarlos y procesarlos para la identificación taxonómica.

Protocolo

Los animales utilizados en los siguientes experimentos fueron encontrados muertos como atropellos.

1. Necropsia animal y cribado de órganos principales para la recolección de helmintos

1. Coloque al animal sobre una superficie plana y examine todas las aberturas externas, incluidos los oídos, la cavidad bucal y los ojos, con una lupa para detectar la presencia de nematodos (redondos) y trematodos (planos y no segmentados) (ver Figura 1).
2. Si trabajas con aves, lávalas con agua del grifo para humedecer las plumas antes de diseccionarlas.
3. Con una cuchilla afilada o un cuchillo y con la ayuda de un par de pinzas de disección, haga una incisión sobre la cavidad abdominal teniendo cuidado de no romper ningún órgano. En el caso de las tortugas con un caparazón duro, use una sierra de mano para cortar el hueso en el área del puente entre los escudos pectorales y abdominales.
4. Abra la cavidad torácica como se indicó anteriormente; para animales grandes, es posible que se necesiten cortadores de huesos o una pequeña sierra de mano para cortar las costillas.
5. Si trabaja con aves, examine los sacos de aire in situ antes de extraer cualquier órgano. Use una lupa si es necesario.
6. Examine ambas cavidades en busca de gusanos redondos filariales y trematodos grandes.
7. Antes de extirpar el tracto gastrointestinal de la cavidad abdominal, ate un hilo cerca del comienzo del esófago y otro al final del intestino grueso (recto).
8. Separe los siguientes órganos torácicos en placas de Petri (o bandejas de vidrio si los órganos son demasiado grandes) para examinarlos con un microscopio estereoscópico (10-30X): corazón y vasos sanguíneos principales, tráquea y pulmones.
9. Extraer el hígado, la vesícula biliar y el conducto, el páncreas, el bazo, los riñones y la vejiga urinaria y examinarlos como se describe en el paso 1.8.
10. Retire todo el sistema digestivo y coloque cada sección en platos/bandejas de vidrio.
11. Una vez extraídos los órganos, lavar la cavidad corporal con una manguera o un frasco con un atomizador lleno de solución salina al 0,9% en un tamiz de malla de 106 μm y examinar el contenido del tamiz bajo un microscopio estereoscópico para detectar la presencia de gusanos filariales o trematodos sanguíneos.
12. Abra cada sección del tracto digestivo con unas tijeras, raspe la mucosa y examine cuidadosamente la presencia de parásitos grandes (>1 cm). Use una lupa si es necesario. Los probóczigs de los acantocéfalos a menudo están profundamente incrustados en la pared del intestino y pueden tener que ser extraídos cuidadosamente del tejido con pinzas y/o tijeras pequeñas.
13. Coloque cada sección abierta bajo agua corriente y lave todo el contenido en un tamiz de 106 μm como se describe en el paso 1.11.
14. Abrir el corazón y los vasos sanguíneos principales (pulmonares y aorta), la tráquea y la vesícula urinaria y biliar y examinar el contenido de la misma manera.
15. Cortar y separar órganos sólidos como los pulmones, el hígado, los riñones, el bazo y el páncreas con una cuchilla afilada y fórceps. Lávelos con agua corriente en un tamiz de 106 μm como se describe en el paso 1.11.
16. Registre los tipos de parásitos encontrados, el número de cada tipo y los órganos en los que se encuentran. Los métodos de fijación y tinción se enumeran a continuación.
17. Etiquete los viales/frascos colocando un pequeño pedazo de una tarjeta de índice simple escrita con lápiz (la tinta y las tarjetas de índice con rayas se "correrán" en alcohol y mancharán las muestras).

2. Conservación de helmintos

1. En el caso de los helmintos que deben conservarse para estudios genéticos posteriores, colóquelos directamente en etanol al 80-90% (sin glicerina). El etanol debe fabricarse diluyendo etanol al 95%, preferiblemente de grado reactivo (Tabla 1). Nunca permita que estos especímenes se expongan a la formalina, ya que la formalina degrada el ADN a un estado inutilizable.
2. Coloque trematodos vivos en un portaobjetos de microscopio de vidrio en una gota de solución salina, coloque un cubreobjetos de vidrio y pase el portaobjetos sobre una llama sin hervir la solución salina.
   1. Coloque el portaobjetos en una placa de Petri que contenga AFA (alcohol-formalina-ácido acético, consulte la Tabla 1) y deje que el portaobjetos de la cubierta flote.
   2. Fije en AFA durante uno o varios días, enjuague con agua del grifo y transfiera a viales de vidrio de 5 ml (o vial/frasco de vidrio más grande según el tamaño y la cantidad de parásitos) llenos de etanol al 70% para almacenamiento a largo plazo.
3. Fije los trematodos muertos en AFA o formalina tamponada al 10% durante 48 horas y luego transfiéralos a un vial/frasco lleno de etanol al 70% para su almacenamiento a largo plazo.
4. Relaje los cestodos vivos en una placa de Petri vertiendo agua casi hirviendo sobre ellos y luego transfiéralos a un vial/frasco lleno de etanol al 70% para su almacenamiento a largo plazo.
5. Relájese los acantocéfalos vivos colocándolos en una placa de Petri durante una a varias horas en agua del grifo en un refrigerador (~ 4 ° C) hasta que la probóscide esté completamente evertida (esto puede demorar hasta 24 horas). Transfiera a un vial/frasco lleno de etanol al 70% o AFA para almacenamiento a largo plazo.
6. Trate a los cestodos y acantocéfalos muertos de la misma manera que a los trematodos muertos (ver arriba).
7. Mata los nematodos vivos pequeños (<5 mm) o frágiles (por ejemplo, tricostrongílidos, capilares) en etanol caliente (casi hirviendo) al 70% y conserva en un vial/frasco lleno de etanol al 70% con glicerina al 5% añadido (Tabla 1) para preservar las lombrices en caso de evaporación.
8. Mata (y elimina) los nematodos medianos a grandes (>5 mm) (por ejemplo, ascáridos, espirúridos, oxiúridos, filáridos) colocándolos en una placa de Petri con ácido acético glacial frío (Tabla 1) y después de 15 minutos transfiéralos a un vial/frasco lleno de etanol al 70% y glicerina al 5%. El ácido acético se puede utilizar repetidamente de esta manera.
9. Coloque los nematodos muertos directamente en un vial/frasco lleno de 70% de etanol y 5% de glicerina.

3. Identificación taxonómica de helmintos

1. Prepare la hematoxilina de Harris disolviendo la hematoxilina en alcohol y disolviendo el sulfato de amonio y aluminio en agua con calor. Mezcle ambas soluciones y deje hervir.
   1. Agregue el yodato de sodio y hierva durante 2-3 min. Filtre la solución (papel de filtro 541) después de que vuelva a temperatura ambiente.
2. Teña en exceso los trematodos, cestodos y acantocéfalos dejándolos en hematoxilina de Harris diluida (1:10) o carmín de Semichon durante la noche (ver Tabla 1).
   1. Elimine las manchas con etanol ácido al 70% hasta que los órganos sean visibles (puede tardar entre unos segundos y más de una hora y debe observarse de cerca).
   2. Detenga la eliminación de manchas transfiriendo las muestras a etanol básico al 70% durante al menos 30 minutos. A continuación, deshidratarlos en una serie de etanoles graduados (80%, 95%, 100%) y limpiarlos en xileno o salicilato de metilo.
   3. Monte las muestras en un portaobjetos de microscopio después de agregar una gota de bálsamo de Canadá y un cubreobjetos. Deje secar durante la noche.
3. Limpie nematodos pequeños y medianos y acantocéfalos durante 15-30 min en montajes temporales de lactofenol en un portaobjetos de microscopio con un cubreobjetos.
   1. Use 80% de fenol durante un máximo de 60 minutos para nematodos grandes (ascáridos y espirúridos) y acantocéfalos. Examinar bajo un microscopio óptico (40-400X) para la evaluación de estructuras más pequeñas (espículas masculinas y ganchos).
4. Utilice los siguientes enfoques para el examen de estructuras especiales.
   1. En el caso de los cestodos, corte el escólex y colóquelo en un portaobjetos de microscopio en lactofenol y "aplaste" con un cubreobjetos para medir y contar los anzuelos rostellar (véase la Figura 1B).
   2. En el caso de los nematodos, cortar el extremo anterior y montarlo de cara en un portaobjetos de microscopio con unas gotas de lactofenol (sin cubreobjetos) o en gelatina de glicerina para un montaje permanente (con cubreobjetos) y observar las piezas bucales bajo un microscopio óptico (35-400X) (véase la figura 1D).
   3. Corte las colas de los nematodos grandes y móntelos en un portaobjetos de microscopio en lactofenol con un cubreobjetos para observar las papilas ventrales y la morfología de las espículas de los machos bajo un microscopio óptico (ver Figura 1D).
5. Identificar los parásitos de las especies utilizando una combinación de literatura primaria y referencias taxonómicas estándar, tales como:
   1. Trematodos: Yamaguti (1958, 1971)^3,4 y Gibson et al. ^5-7
   2. Acantocefelanos: Yamaguti⁸
   3. Cestodos: Yamaguti⁹, Schmidt¹⁰ y Khalil et al. ¹¹
   4. Nematodos: Yamaguti¹² y Anderson et al. ¹³

4. Depósito de helmintos en la Colección Nacional de Parásitos de EE. UU.

1. Deposite especímenes representativos de helmintos en la Colección Nacional de Parásitos de los Estados Unidos (USNPC). Esto es obligatorio para la mayoría de las revistas de parásitos. Después de la presentación, a cada especie de helminto se le asigna un número de accesión para su inclusión en los manuscritos.
2. Incluya la siguiente información al enviar las muestras: 1) Nombre científico del parásito; 2) información del anfitrión (especie, coordenadas de longitud/latitud o ubicación geográfica); 3) órgano encontrado en el huésped; 4) nombre de quien recolectó los especímenes y fecha de recolección; 5) tipo de medio de fijación, tinte o limpieza/montaje utilizado; 6) ubicación de otras colecciones (número de museo y número de accesión) si se presentan especímenes adicionales en otro lugar; y 7) información sobre publicación y revista. Estos datos también deben enviarse junto con las muestras y en cubierta separada.
3. Empaque las muestras en recipientes fuertes con material absorbente a prueba de golpes. Tape con cinta adhesiva / tapones de rosca de Parafilm en viales de vidrio y coloque cada vial en una bolsa de plástico separada. Envuelva los portaobjetos en papel y colóquelos en una caja de portaobjetos con material que absorba los impactos entre ellos.
4. Envíe los especímenes y una carta separada con información sobre los especímenes a: U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Resultados

Utilizando los métodos descritos anteriormente, se realizó un estudio sobre los helmintos de la musaraña enmascarada, Sorex cinereus, en el condado de Missoula, Montana, entre 2007 y 2011. Se recolectaron un total de 56 musarañas mediante trampas de caída y se examinaron dentro de las 2 horas posteriores a la muerte. La prevalencia general de infección fue del 96 %; solo 2 musarañas estaban libres de parásitos. Se identificaron quince especies de helmintos, incluyendo 9 especies de cestodos y 6 especies de nemat...

Discusión

Es extremadamente difícil identificar parásitos helmintos, incluso de género, en función de un material pobre. Los cestodos y los trematodos, en particular, tienden a morir y deteriorarse con bastante rapidez después de la muerte del huésped. La taxonomía de los cestodos depende en gran medida del número, tamaño y forma de los anzuelos rosestelares, que a menudo se pierden en el material congelado. Lo mismo se aplica a ciertos trematodos con espinas alrededor del ventoso oral, como los equinostomas y los heterófitos, que...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fijador
Alcohol-formalina-ácido acético (AFA)	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) F75F-1GAL (formaldehído) BP2401500 (ácido acético glacial)	Etanol 85% (85 ml) + formaldehído 37% (10 ml) + ácido acético glacial (5 ml)
Etanol para matar y conservar a largo plazo	Fisher Scientific	A407-1	Etanol 100% (70 ml) + agua destilada (30 ml)
Etanol para fijación y estudios de ADN	Fisher Scientific	AC61511-0010	Etanol 80-90% (80-90 ml) + agua destilada (20-10 ml), respectivamente
Formalina tamponada	Fisher Scientific	SF100-4	Formalina 10% (10 ml) + agua destilada (90 ml)
Glicerina-alcohol	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) AC15365-1000 (glicerina)	Etanol 70% (95 ml) + glicerina (5 ml)
Aclarante, tinte y montaje
Etanol para deshidratar durante la tinción	Fisher Scientific	A407-1	Etanol 80%, 95%, 100% (80 ml, 95 ml, 100 ml) + agua destilada (20 ml, 5 ml, 0 ml)
Lactofenol	Fisher Scientific	R400-27-Phenol
	Fisher Scientific	A931I-1 (fenol) A407-1 (etanol)	Fenol 100% (80 ml) + etanol 100% (20 ml)
Harris' Hematoxilina	Fisher Scientific	S25347 (hematoxilina) A407-1 (etanol) A567-500 (sulfato de amonio y aluminio) S25553 (yodato de sodio)	Hematoxilina (5 g) + etanol 100% (50 ml) + sulfato de amonio y aluminio (100 g) + yodato de sodio (0,37 g) + agua destilada (1.000 ml)
Semichón' s carmín acético Fisher	Scientific	BP2401500 (ácido acético glacial) S25236 (carmín) A407-1 (etanol)	Ácido acético glacial (100 ml) + carmín (1,5 g) + agua destilada (100 ml). Calentar en un baño de agua hirviendo durante 15 min y enfriar. Filtre para hacer una solución madre. Mezcle 1:2 con 70% de alcohol para manchar.
Xylene	Fisher Scientific	X4-4	Úselo solo debajo de una campana de gases químicos.
Salicilato de metilo	Fisher	Scientific S25437-Etanol
básico	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) S25159A (hidróxido de amonio concentrado)	Etanol 70% (100 ml) + hidróxido de amonio (0,1 ml)
Etanol ácido	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) SA9233-100 (ácido clorhídrico)	Etanol 70% (99,5 ml) +  ácido clorhídrico (0,5 ml)
Bálsamo de Canadá	Fisher Scientific	B10-100	-