Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Resumen

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam ₃ CSK ₄ (Pam).

Resumen

El aislamiento de microglia de tejido del SNC es una poderosa herramienta de investigación utilizada para estudiar la biología microglial ex vivo. El presente método detalla un procedimiento para el aislamiento de la microglía de las cortezas murinos neonatales por agitación mecánica con un agitador rotatorio. Este aislamiento microglia método rendimientos microglia corticales altamente puros que exhiben características morfológicas y funcionales indicativos de la microglia en reposo en condiciones normales, no patológicas in vivo. Este procedimiento también preserva el inmunofenotipo de la microglia y la funcionalidad bioquímica como se demuestra por la inducción de cambios morfológicos, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-kappa B (p65), y la secreción de la citoquina proinflamatoria sello, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α ), al lipopolisacárido (LPS) y Pam ₃ CSK ₄ (Pam) desafíos. Por lo tanto, el presente procedimiento de aislamiento conserva el inmunofenotipo de tanto reposo y Actimicroglia vada, proporcionando un método experimental de la investigación de la biología de la microglía en condiciones ex vivo.

Introducción

Las células microgliales, los macrófagos de vigilancia de la parénquima del SNC, comprenden aproximadamente el 12% de la población total de células del cerebro de los mamíferos adultos. La microglía se derivan de saco vitelino mieloides precursoras células y varían en densidad celular y la morfología en diferentes regiones cytoarchitectural en el SNC adulto ^1-5. En un cerebro adulto sano, la microglia son células pequeñas, ramificadas o polares, con procesos dinámicos finos. En contraste con la morfología de los macrófagos periféricos, microglia demuestran un reposo, de bajo perfil fenotipo en cerebros sanos que pueden aparecer como la inactividad celular, sin embargo, en los estudios de imagen in vivo demuestran que los procesos microgliales se extienden de forma dinámica y se retraen para monitorear su microambiente de una manera que recuerda a " muestreo y de estudio ^"6,7.

La microglía son altamente y diferencialmente sensibles a alteraciones ambientales y fisiopatológicos en el cerebro, de conmutacióndesde un surveillant a un estados considerados como su reposo y activadas comúnmente estatales efectoras, respectivamente. Este interruptor de activación puede estar mediada por la participación de los receptores de membrana de reconocimiento de patrones (PRRS), como los receptores tipo Toll (TLR), que responden a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), lipoproteínas de saber bacterianas-y derivados-viral , ácidos nucleicos, hidratos de carbono y ^8-11. Además de PAMP, parentales también se han mostrado para inducir la activación microglial contra moléculas estériles, no patógenas conocidas como patrones moleculares peligro / daño-asociado (apaga), que representan una perturbación en la homeostasis del SNC, tales como daño celular ^12-16. Una vez enganchado, PRRS inician una cascada de señalización intracelular que resulta en cambios en la morfología celular microglial y la expresión génica; específicamente, microglia activada adaptar un fenotipo-ameboide como, translocate la p65 de NF-kappa B subunidad (p65) para el núcleo de la célula, y la upregulate producción y la secreción de citocinas proinflamatorias, tales como factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), la interleucina-1 β (IL-1β), junto con especies de oxígeno reactivas (ROS) ^16-24. Aunque integral en la respuesta inmune innata del sistema nervioso central, también se han encontrado estas moléculas secretadas para aumentar el estrés oxidativo neuronal, induciendo de ese modo y exacerbando la neurodegeneración en estados de enfermedad tales como Parkinson y la enfermedad de Alzheimer ^25-29.

Sin embargo, los mecanismos de activación microglial en estados patológicos no se entienden completamente. Por lo tanto, el aislamiento de microglia es una poderosa herramienta de investigación en estos procesos biológicos, como muchos en funciones in vivo de la activación microglial puede ser recapitulado en la cultura. Varios métodos están disponibles para el aislamiento de la microglía, incluyendo el aislamiento a través de un gradiente de Percoll después de la digestión enzimática de tejido del SNC ^30,31. Sin embargo, la digestión enzimática puede alterarel inmunofenotipo de las células mediante la reducción de la superficie celular la expresión del antígeno ^32, y los resultados en el rendimiento de células por animal inferior que el método descrito en el presente documento. En concreto, se presenta un rendimiento promedio microglia por corteza cachorro de 7,5 x 10 ⁵ células, mientras que los métodos de aislamiento de todo el SNC ya se ha informado a través de un rendimiento gradiente de Percoll 3-5 x 10 ⁵ células ^30,33,34. El presente procedimiento evita el uso de enzimas de digestión mediante el aislamiento de la microglia en base a sus propiedades de baja adherencia, preservando así el inmunofenotipo y la funcionalidad de la microglia.

En el presente estudio, se describe el aislamiento de las células microgliales de mezcla de culturas gliales derivadas de heterocigotos CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP ^{+ / -)} neonatales, y C57BL / 6 corticales murinas mediante agitación mecánica en un agitador rotatorio, una extensión de anterioridad publicado ^24,35 método. Utilizamos la antigua cepa de ratón para facilitar la visualización de la microglia, comoestos ratones expresan GFP bajo el control del locus endógeno CX3CR1 - un promotor específico de los monocitos ^36-38. Este método produce microglial culturas altamente puro con un inmunofenotipo conservados ex vivo como se demuestra por cambios morfológicos, la translocación nuclear de p65, y la secreción de TNF-α cuando son desafiados con lipopolisacárido bacteriano (LPS) o Pam ₃ CSK _4, TLR4 y TLR1 / 2 agonistas , respectivamente.

Protocolo

Antes de iniciar este protocolo, recoger ratones recién nacidos en los días postnatales 1-3 (P1-3) en un recipiente estéril anidado con ropa de cama caja original para protegerlo y abrigarlo. Es importante trabajar de manera rápida y eficiente a través de este protocolo para optimizar el rendimiento de la microglia. Por favor consulte la Tabla 1 para la lista completa de reactivos.

1. Elaboración de instrumentos, medios de cultivo, y platos

1. Preparar 10 ml / cachorro microglía completo Media (MCM; 1x Esencial Mínimo de Medio Earle [MEM] suplementado con: 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0,6% v / v de D-(+)-glucosa, 100 g / ml La penicilina / estreptomicina (P / S), 4% v / v de suero bovino fetal (FBS), 6% v / v de suero de caballo), y añadir a cada matraz T-75 (1 matraz / PUP); tapa y horizontalmente en lugar una incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂₎ equilibrar durante 1 hora. Es esencial para equilibrar este medio en un matraz (s) antes de comenzar la disección.
2. PrepaRe, alícuota, y caliente en 37 ° C MCM baño de agua para la disección (6 ml / PUP) y en un tubo cónico de MCM separada para la resuspensión celular (2 ml / PUP). Preparar, alícuota, y enfriar en hielo Picado de medios (MM; HBSS suplementado con: 100 mg / ml P / S, 0,01 M HEPES; 3 ml / cría), y disección de medio (DM; MEM suplementado con 100 mg / ml P / S, 2 ml / perrito).
3. Esterilizar las siguientes herramientas quirúrgicas por inmersión en etanol al 70% durante 10 min: tijera # 1 (1; decapitar), fórceps # 1 (2, para asegurar la nariz y eliminar las cortezas), tijera # 2 (1; nonangled; para abrir el cuero cabelludo ), fórceps # 2 (1; para quitar el cuero cabelludo), fórceps # 3 (1; para eliminar cráneo), fórceps # 4 (2; para eliminar meninges), tijera # 3 (1; pelos en el tejido cerebral). Deje secar al aire en una gasa estéril.
4. Limpie la estación de trabajo y la disección microscopio horizontal con flujo de aire con 70% de etanol.
5. Dispense DM en 2, 100 mm placas de Petri estériles para la captura de la cabeza (3 ml; 1 plato / 3 cachorros) y la disección (1 ml;1 plato / crías; enfriada en hielo antes de la disección). Dispense MM en 1 estéril, 100 mm placa de Petri para picar el tejido cerebral (1 ml, 1 plato / perrito).

2. Tejido Cerebral Disección

1. Antes de la eutanasia, desinfectar suavemente el cuello y la cabeza del cachorro con etanol al 70%, utilizando un pañuelo de papel de laboratorio. Con tijera # 1, la eutanasia rápidamente mediante la eliminación de las crías de la cabeza, la cabeza de captura en placa de Petri previamente preparado. La eutanasia y completar la disección de una cría antes de proceder a la siguiente animal.
2. Transfiera la cabeza al plato disección fría; bajo el microscopio de disección asegurar la cabeza apretando la nariz usando fórceps # 1 (como alternativa, la cabeza puede ser asegurada por la perforación de las pinzas a través de la cuenca del ojo); cuero cabelludo abierto utilizando tijeras # 2 por la creación de un Y-cut: comenzar desde la base de la cabeza y en un ángulo hacia los ojos. Utilice fórceps # 3 para eliminar suavemente el cuero cabelludo, quitando lateralmente, exponiendo el cráneo.
3. El uso de fórceps # 3, remover suavemente el tejido conectivo en la base decabeza. Cuando la base del cráneo está expuesto el cráneo, abra cuidadosamente enroscando un brazo de pinza entre el cerebro y el cráneo (siguiendo la cisura interhemisférica); agarre, tire suavemente el cráneo hacia arriba para rasgar.
4. Interrumpir el tejido conectivo debajo de la parte ventral de cerebro usando fórceps # 1, y posteriormente eliminar el cerebro utilizando la misma herramienta. Levantar el cerebro fuera del cráneo mediante el uso de una fuerza hacia arriba bajo la parte ventral del cerebro.
5. Mantener el cerebro en su posición anatómica: frente lado dorsal hacia arriba para visualizar las cortezas bajo el microscopio de disección; asegurar el cerebro en su lugar mediante la inserción de puntas de pinzas en la intersección del cerebro medio y la corteza; eliminar completamente las meninges corticales con fórceps # 4, a continuación, proceder a retirar las meninges ventral. Una vez que las meninges se han separado completamente, separe las cortezas de la parte restante del cerebro utilizando fórceps # 4. Es esencial para eliminar por completo el tejido meníngeo para maximizar la pureza microglia y yield.

3. Tejido Cerebral Picado

1. Cortezas de transferencia para preparar previamente picado plato; seguir picando paso utilizando una técnica estéril en la categoría II del Gabinete de Seguridad Biológica.
2. Pique tejido cerebral usando tijera # 3, la transferencia de tejido picado a un tubo cónico de 15 ml;. Enjuague tijeras y picado plato con 1 ml de mM de cada uno, recoger y dispensar enjuagues en el tubo cónico de 15 ml que contiene el tejido picado Este paso de enjuague maximizará el rendimiento de la microglia, asegurando que todo el tejido residual se transfiere al tubo cónico. Deja suspensión de tejido en reposo durante 1-2 min, permitiendo tejido picado se asiente en el fondo del tubo. No exceda de 2 min como MM no contiene nutrientes esenciales.
3. Retire con cuidado y deseche 2 ml de sobrenadante con micropipeta genérica 1.000 l con una punta de pipeta estándar, asegurándose de no perturbar el tejido picado resuelto.
4. Añadir 3 ml de MCM a la-tejido picado; se tritura el tejido con toda su fuerza usando un 1,000 l genérico micropipeta con una punta de pipeta estándar No se discernible tejido sólido debe permanecer cuando la trituración es completa.. Agregar otro 3 ml de MCM con la misma punta de la pipeta, la recogida de la muestra se tritura residual de la punta de la pipeta.

4. El cultivo de células corticales

1. Se centrifuga el tejido picado para que sedimenten las células (215 xg, 5 min; RT; centrífuga clínica con rotor basculante). Volver células sedimentadas a la cabina de seguridad biológica, retirar y desechar el sobrenadante, resuspender suavemente el sedimento celular (2 ml / tubo; MCM), añadir la resuspensión celular a la T-75 frasco previamente preparado; tapar el frasco y colocarla horizontalmente en un humidificado, incubadora de cultivo de tejidos estándar (37 ° C, 5% de CO _2). Permitir que las células se incuban durante 24 horas.
2. Después de 24 horas, toque suavemente frasco contra la palma de la mano para interrumpirrestos de tejido. Compruebe las células antes y después de tocar a asegurar la completa eliminación de los desechos. Frasco Set vertical; retirar y eliminar los medios de comunicación; añadir MCM fresco al fondo del frasco (12 ml; 37 ° C); tapa y colóquelo de nuevo en la incubadora, horizontalmente.
3. Compruebe células diaria de contaminación y para monitorear el crecimiento.
4. En aproximadamente 17 a 21 días in vitro (DIV), las células microgliales estarán listos para la cosecha del cultivo glial mixto. Para determinar si las células están listas, examinar las células bajo un microscopio de contraste de fase invertida. Microglia están listos para la cosecha, cuando en ~ 40% de confluencia. Aparecen como células pequeñas, brillante, esféricas, creciendo como una monocapa sobre otro glia.

5. El aislamiento de microglia de glial mixto Cultura

1. Para aislar la microglía, toque vigorosamente frasco contra la mesa de laboratorio. Esta agitación ayuda a microglia separadas de otras células gliales debido a las propiedades de baja adherencia de la microglia.
2. Sello T-75 caps matraz con Parafilm y rotar los cultivos mixtos gliales (200 rpm; 37 ° C, 5 h). utilizando un agitador rotatorio nonhumidified temperatura controlada No permitir que las células se dan durante más de 5 horas Inspeccione visualmente. que la microglia se han levantado de la superficie del matraz después de 5 horas, utilizando un microscopio de contraste de fase invertida. microglía son brillantes, esférico, células de flotación libre. Habrá una capa residual de astrocitos y oligodendrocitos que se adhieren a la parte inferior del matraz.
3. Recoger medio sobrenadante que contienen microglia en un tubo de centrífuga cónico estéril; microglia pellets (215 xg, 5 min; rotor con cubeta oscilante).
4. Resuspender el precipitado de la microglia en caliente Microglial Medio de Crecimiento (MGM; MEM suplementado con: 1 mM piruvato de sodio, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamina, 100 mg / ml de P / S, 5% v / v de FBS; ~ 2 ml / matraz), determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro, y la placa de 1 x 10 ⁵ células / pocillo en un formato de placa de 24 pocillos enplástico o resbalones estériles cubierta de vidrio (500 l / pocillo; MGM). Mediante este procedimiento el rendimiento promedio microglia es cortex 7,5 x 10 ⁵ células / cachorro.
5. 24 horas después de la galvanoplastia, quite todos los medios de comunicación y las células de realimentación con MGM fresco (37 º C) para eliminar las células flotantes y escombros. Este paso es fundamental para la supervivencia celular y mantener microglia en reposo. Las células pueden ser utilizados para la experimentación inmediatamente después de la realimentación.

6. Tratamientos Ejemplo

1. Exponer las células a 10 ng / ml de Pam ₃ CSK ₄ (Pam), 10 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) o de control del vehículo; incubar durante 2 o 24 horas en incubador humidificado (37 ° C, 5% de CO _2).

7. Analizando Microglia para Funcionalidad ex vivo a través de inmunofluorescencia de Imágenes e inmunocitoquímica

1. Después del tratamiento, los medios de cultivo celular de cosecha en tubos de microcentrífuga (1,5 ml) y Centrifuge utilizando una microcentrífuga de mesa (2 min; 900 xg) para borrar los medios de comunicación. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio; ensayo inmediatamente o almacenar a -20 ° C hasta su utilización. Analizar la concentración de TNF-α en células de cultivo sobrenadante a través de kit de ELISA de TNF-α ratón comercialmente disponible.
2. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y fijar las células con 4% (w / v) de paraformaldehído / 4% (w / v) de sacarosa / PBS a pH 7,4 (4% de PFA; 15 min; RT). Después de la fijación, lavar las células con PBS durante 5 min con agitación suave en un agitador orbital.
   1. Inmunofluorescencia / inmunocitoquímica. Después de la fijación y lavado con PBS, la microglía proceso para inmunocitoquímica. Todos los pasos llevados a cabo con agitación suave. Permeabilizar las células en PBS/0.1% de Triton X-100; células de bloques en PBS/10% de suero normal de cabra durante una hora. Se incuban las células de O / N a 4 ° C con anticuerpo de conejo anti-NF-kB (subunidad p65; 1/1, 250) o de conejo anti-Iba-1 anticuerpo (1/750) en tampón de bloqueo. Visualize complejo antígeno: anticuerpo tras la incubación con fluorescente conjugado de cabra anti-conejo de anticuerpos IgG secundaria (1 hora, 1/1, 000). Se quita el anticuerpo secundario no unido por lavado con PBS/0.1% de Triton X-100 (3x 5 min).
   2. Células de manchas contador con 4 ',6-diamidino-2-fenilindol / PBS (DAPI; 0,1 g / ml). Para visualizar el núcleo de la célula Todos microglia derivados de CX3CR1-GFP ^{+ / -} ratones expresan GFP. Utilizar un filtro de longitud de onda de 350 nm a visualizar DAPI; un filtro de longitud de onda de 488 nm a visualizar GFP, y un filtro de longitud de onda de 594 nm a visualizar p65 y Iba-1 inmunocomplejos.
3. Monte la cubierta se desliza usando una solución de montaje acuoso y visualizar microglia utilizando microscopía fluorescente.

Resultados

Conservando el inmunofenotipo y la funcionalidad de la microglia ex vivo durante el aislamiento es crítico para ser capaz de utilizar estas células como un modelo de investigación para la biología de la microglia. Con el fin de demostrar la preservación con éxito de immunofunctionality microglia utilizando el presente método, se aislaron microglia corticales de los recién nacidos P3 (CX3CR1-GFP ^{+ / -} y ratones C57BL / 6) y los cultivos tratados con LPS o Pam.

Como se ilus...

Discusión

El presente procedimiento ofrece un método eficaz para el aislamiento de la microglia corticales de ratones neonatales. Este procedimiento tiene un doble beneficio de 1) preservar inmunofenotipo la microglia y la funcionalidad, según lo determinado por proyección de imagen fluorescente, inmunocitoquímica, y ELISA, y, 2) que permite la microglía a madurar en presencia de otras células gliales (astrocitos y oligodentrocytes) antes de la aislamiento, lo que puede facilitar importantes interacciones célula-célula durante el...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glucosa	Sigma	G8270	Prepare una solución madre al 20% con agua MilliQ; esterilizar por filtro; almacenar a 4 & grados; C; Vida útil: 3-6 meses. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Piruvato de sodio 100 mM (100x)	Hyclone	SH30239.01	Almacenar a 4 °C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Penicilina/Estreptomicina 10,000 unidades/ml (100x)	Gibco	15140-122	Almacenar en -20 °C. Se utiliza para hacer MCM, MGM, MM y DM.
L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Almacenar a -20 °C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Suero Fetal Bovino (Definido)	Hiclón	SH30070.03	Esterilización por filtro; almacenar a -20 °C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Medio Esencial Mínimo Earle's (MEM)	Cellgro	15-010-CV	Sin L-glutamina. Contiene sales de Earle. Se utiliza para hacer MCM, MGM y DM.
Suero de caballo	Gibco	16050	Filtro esterilizante; almacenar a -20 ° C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Cellgro	21-021-CV	Sin calcio ni magnesio. Almacenar a 4 °C. Se utiliza para hacer MM.
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	Tienda en 4 °C. Se utiliza para hacer MM.
T-75 Matraz	Corning	430641
4',6-Diamidino-2-fenilindol, dilactato (DAPI)	Invitrogen	D3571	Se utiliza para teñir el núcleo celular.
Conejo anti-Iba1	Wako	019-19741	Utilizado en dilución 1/750 para la tinción ICC de Iba1.
Conejo anti-NFκ B (p65)	Abcam	7970	Se utiliza con una dilución de 1/1.250 para la tinción ICC de p65.
Alexa Fluor 594 Cabra anti-Conejo IgG (H+L)	Invitrogen	A11012	Utilizado en dilución 1/1.000 para la visualización del complejo antígeno:anticuerpo en ICC.
10 ml Pipeta Serológica Desechable	Fisher Scientific	13-678-11E
50 ml Tubo de Centrífuga Desechable	Fisher Scientific	05-539-8
15 ml Tubo de Centrífuga Desechable	Fisher Scientific	05-539-12
Placa de Petri de Poliestireno Estéril	Fisher Scientific	875713	100 mm x 15 mm
Tijera: Recta Metzembaum (tijera #1)	Roboz Surgical	RS-6010	1; 5 pulgadas; utilizado para quitar la cabeza
Tijera: Vannas (tijera #2)	Fine Science Tools	15000-08	1; no angulado; filo de corte de 2,5 mm; utilizado para abrir el cuero cabelludo
Tijera: Student Vannas (tijera #3)	Fine Science Tools	91501-09	1; curvado; utilizado para picar tejido cerebral
Pinza: Dumont #7 (pinza #1)	Fine Science Tools	91197-00	2; Se utiliza para asegurar la nariz y eliminar las cortezas
Pinza: Dumont #2 (pinza #2)	Fine Science Tools	11223-20	1; utilizada para extirpar el cuero cabelludo
Pinza: Dumont #3 (pinza #3)	Fine Science Tools	11231-30	1; utilizada para extraer el cráneo
Pinza: Dumont #5a (pinza #4)	Fine Science Tools	11253-21	1; utilizada para extirpar meninges
Tabla de Equipos Específicos
Microscopio de disección estereoscópica con zoom	El	Olympus SZ4060	se coloca dentro de la cabina de flujo laminar-horizontal
Cabina de flujo laminar-horizontal	Nuaire	NU-201-330
Cabina de seguridad biológica	Labconco	3440001	Clase II
con camisa de agua CO2	Incubadora VWR	97025-836	Ajustado a 37 ° C, 5% CO2
Swing-out Cubos Fisher	Scientific	75006441	Para ser utilizado con Rotor basculante Rotor basculante
	Fisher Scientific	75006445	máx.: 19,2 (cm)
Centrífuga Sorvall Legend RT+ (centrífuga clínica)	Fisher Scientific	75-004-377	Con rotor basculante
Microcentrífuga AccuSpin Micro 17 ( microcentrífuga de mesa)	Fisher Scientific	S98645	Con rotor de microlitros (24 x 1,5/2,0 ml; Gato #: 75003524)