Artículo de método

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

DOI:

10.3791/51005

⸱

30 de enero de 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Resumen

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El aislamiento de microglia de tejido del SNC es una poderosa herramienta de investigación utilizada para estudiar la biología microglial ex vivo. El presente método detalla un procedimiento para el aislamiento de la microglía de las cortezas murinos neonatales por agitación mecánica con un agitador rotatorio. Este aislamiento microglia método rendimientos microglia corticales altamente puros que exhiben características morfológicas y funcionales indicativos de la microglia en reposo en condiciones normales, no patológicas in vivo. Este procedimiento también preserva el inmunofenotipo de la microglia y la funcionalidad bioquímica como se demuestra por la inducción de cambios morfológicos, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-kappa B (p65), y la secreción de la citoquina proinflamatoria sello, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α ), al lipopolisacárido (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam) desafíos. Por lo tanto, el presente procedimiento de aislamiento conserva el inmunofenotipo de tanto reposo y Actimicroglia vada, proporcionando un método experimental de la investigación de la biología de la microglía en condiciones ex vivo.

Introducción

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Las células microgliales, los macrófagos de vigilancia de la parénquima del SNC, comprenden aproximadamente el 12% de la población total de células del cerebro de los mamíferos adultos. La microglía se derivan de saco vitelino mieloides precursoras células y varían en densidad celular y la morfología en diferentes regiones cytoarchitectural en el SNC adulto 1-5. En un cerebro adulto sano, la microglia son células pequeñas, ramificadas o polares, con procesos dinámicos finos. En contraste con la morfología de los macrófagos periféricos, microglia demuestran un reposo, de bajo perfil fenotipo en cerebros sanos que pueden aparecer como la inactividad celular,....

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Protocolo

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Antes de iniciar este protocolo, recoger ratones recién nacidos en los días postnatales 1-3 (P1-3) en un recipiente estéril anidado con ropa de cama caja original para protegerlo y abrigarlo. Es importante trabajar de manera rápida y eficiente a través de este protocolo para optimizar el rendimiento de la microglia. Por favor consulte la Tabla 1 para la lista completa de reactivos.

1. Elaboración de instrumentos, medios de cultivo, y platos

  1. Preparar 10 ml / cachorro microglía completo Media (MCM; 1x Esencial Mínimo de Medio Earle [MEM] suplementado con: 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0,6% v / v de....

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Resultados

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Conservando el inmunofenotipo y la funcionalidad de la microglia ex vivo durante el aislamiento es crítico para ser capaz de utilizar estas células como un modelo de investigación para la biología de la microglia. Con el fin de demostrar la preservación con éxito de immunofunctionality microglia utilizando el presente método, se aislaron microglia corticales de los recién nacidos P3 (CX3CR1-GFP + / - y ratones C57BL / 6) y los cultivos tratados con LPS o Pam.

Como se ilus.......

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Discusión

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El presente procedimiento ofrece un método eficaz para el aislamiento de la microglia corticales de ratones neonatales. Este procedimiento tiene un doble beneficio de 1) preservar inmunofenotipo la microglia y la funcionalidad, según lo determinado por proyección de imagen fluorescente, inmunocitoquímica, y ELISA, y, 2) que permite la microglía a madurar en presencia de otras células gliales (astrocitos y oligodentrocytes) antes de la aislamiento, lo que puede facilitar importantes interacciones célula-célula durante el.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiero que puedan interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el NIEHS R01ES014470 (KMZ).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
GlucosaSigmaG8270Prepare una solución madre al 20% con agua MilliQ; esterilizar por filtro; almacenar a 4 & grados; C; Vida útil: 3-6 meses. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Piruvato de sodio 100 mM (100x)HycloneSH30239.01Almacenar a 4 °C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Penicilina/Estreptomicina 10,000 unidades/ml (100x)Gibco15140-122Almacenar en -20 °C. Se utiliza para hacer MCM, MGM, MM y DM.
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081Almacenar a -20 °C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Suero Fetal Bovino (Definido)HiclónSH30070.03Esterilización por filtro; almacenar a -20 °C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Medio Esencial Mínimo Earle's (MEM)Cellgro15-010-CVSin L-glutamina. Contiene sales de Earle. Se utiliza para hacer MCM, MGM y DM.
Suero de caballoGibco16050Filtro esterilizante; almacenar a -20 ° C. Se utiliza para hacer MCM y MGM.
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)Cellgro21-021-CVSin calcio ni magnesio. Almacenar a 4 °C. Se utiliza para hacer MM.
HEPES 1 MGibco15630-031Tienda en 4 °C. Se utiliza para hacer MM.
T-75 MatrazCorning430641
4',6-Diamidino-2-fenilindol, dilactato (DAPI)InvitrogenD3571Se utiliza para teñir el núcleo celular.
Conejo anti-Iba1Wako019-19741Utilizado en dilución 1/750 para la tinción ICC de Iba1.
Conejo anti-NFκ B (p65)Abcam7970Se utiliza con una dilución de 1/1.250 para la tinción ICC de p65.
Alexa Fluor 594 Cabra anti-Conejo IgG (H+L)InvitrogenA11012Utilizado en dilución 1/1.000 para la visualización del complejo antígeno:anticuerpo en ICC.
10 ml Pipeta Serológica DesechableFisher Scientific13-678-11E
50 ml Tubo de Centrífuga DesechableFisher Scientific05-539-8
15 ml Tubo de Centrífuga DesechableFisher Scientific05-539-12
Placa de Petri de Poliestireno EstérilFisher Scientific875713100 mm x 15 mm
Tijera: Recta Metzembaum (tijera #1)Roboz SurgicalRS-60101; 5 pulgadas; utilizado para quitar la cabeza
Tijera: Vannas
(tijera #2)		Fine Science Tools15000-081; no angulado; filo de corte de 2,5 mm; utilizado para abrir el cuero cabelludo
Tijera: Student Vannas (tijera #3)Fine Science Tools91501-091; curvado; utilizado para picar tejido cerebral
Pinza: Dumont #7
(pinza #1)		Fine Science Tools91197-002; Se utiliza para asegurar la nariz y eliminar las cortezas 
Pinza: Dumont #2
(pinza #2)		Fine Science Tools11223-201; utilizada para extirpar el cuero cabelludo
Pinza: Dumont #3
(pinza #3)		Fine Science Tools11231-301; utilizada para extraer el cráneo
Pinza: Dumont #5a
(pinza #4)		Fine Science Tools11253-211; utilizada para extirpar meninges
Tabla de Equipos Específicos
Microscopio de disección estereoscópica con zoom ElOlympus SZ4060se coloca dentro de la cabina de flujo laminar-horizontal
Cabina de flujo laminar-horizontalNuaireNU-201-330
Cabina de seguridad biológicaLabconco3440001Clase II
con camisa de agua CO2Incubadora VWR97025-836Ajustado a 37 ° C, 5% CO2
Swing-out Cubos FisherScientific75006441Para ser utilizado con Rotor basculante Rotor basculante
Fisher Scientific75006445máx.: 19,2 (cm)
Centrífuga Sorvall Legend RT+
(centrífuga clínica)		Fisher Scientific75-004-377Con rotor basculante
Microcentrífuga AccuSpin Micro 17
( microcentrífuga de mesa)		Fisher ScientificS98645Con rotor de microlitros (24 x 1,5/2,0 ml; Gato #: 75003524)   
microscopio Radio

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adul....

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Etiquetas

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