Artículo de método

Métodos de recolección de leche Ratones y Reeves Muntjac Deer

20.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

19 de julio de 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

En este artículo

Resumen

La recolección de leche a partir de modelos animales facilita varias vías de investigación: comprender la inmunidad pasiva, identificar patógenos responsables de la transmisión vertical y, mediante el uso de ratones transgénicos, incluso la producción comercial de proteínas que se encuentran en la leche materna humana. Aquí ilustramos un método simple para la recolección de leche en ratones y ciervos muntjac de Reeves.

Resumen

Los modelos animales se utilizan comúnmente en los laboratorios de investigación para lograr lo que normalmente se consideraría poco práctico en el huésped nativo de un patógeno. La recolección de leche de animales permite a los científicos la oportunidad de estudiar muchos aspectos de la reproducción, incluida la transmisión vertical, la inmunidad pasiva, la biología de la glándula mamaria y la lactancia. Obtener volúmenes adecuados de leche para estos estudios es una tarea difícil, especialmente a partir de modelos animales pequeños. Aquí ilustramos un método barato y fácil para la recolección de leche en ratones y ciervos muntjac de Reeves que no requiere equipo especializado ni capacitación extensa. Este método en particular requiere dos investigadores: uno para extraer la leche y estabilizar al animal, y otro para recolectar la leche en un recipiente apropiado de un modelo de Muntjac o de ratón. El modelo de ratón también requiere el uso de un pipetman P-200 y las puntas de pipeta correspondientes. Si bien este método es de bajo costo y relativamente fácil de realizar, se debe advertir a los investigadores que es necesario anestesiar al animal para una recolección óptima de leche.

Introducción

Los modelos animales proporcionan información sobre la patología de la enfermedad que no puede ser adquirida mediante el análisis in vitro. Para proporcionar los resultados más eficaces, es importante utilizar un modelo animal que está estrechamente relacionado con la enfermedad y de las especies de interés. Por ejemplo, el muntjac Reeves (Muntiacus reevesi), un pequeño ciervo de Asia 1,2, y los ratones transgénicos que expresan la proteína priónica cérvido (CerTgPrP) 3 son los modelos animales útiles para las especies de cérvidos. Ambas especies son poliestro, lo que permite la cría durante todo el año, y por lo tanto una fuente constante de tejidos y fluidos relacionadas con el embarazo para estudiar mecanismos específicos en la biología cérvido. Los estudios de la leche tienen una amplia gama de aplicaciones que son más simplemente (y barata) realizados en modelos animales que en los seres humanos. Los investigadores podrían investigar la leche y el calostro como fuente potencial de 1) la transmisión de enfermedades infecciosas, 2) las inmunoglobulinas transferidos de madre a hijo en el desarrollo de ciertasllo de la inmunidad pasiva 4 y 3) la lactoferrina, una proteína presente en la leche materna humana implicada en la inmunidad pasiva que los investigadores están tratando actualmente para producir comercialmente 5.

La recolección de una cantidad sustancial de la leche de animales pequeños puede llegar a ser una tarea difícil. Rogers propone un enfoque para recoger la leche de ratas 6, que se utilizó posteriormente en ratones. De Peters y Hovey proponen dos métodos para la recogida de leche, uno utilizando un vacío generado manualmente-producida por un bulbo de pipeta de goma en una pipeta Pasteur, y una segunda que requiere la construcción de una unidad de ordeño, que luego se une a una fuente de vacío (tales como un grifo) para cosechar la leche del ratón 7. Aquí proponemos un método simple y económica para la recogida de leche de ambos ratones y ciervos muntjac Reeves, que requiere equipos de laboratorio sólo disponibles y habilidades técnicas básicas. Nuestro método proporciona un volumen suficiente de leche para variosaplicaciones.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Protocolo de ordeño Ratón

Los métodos descritos en este protocolo fue aprobado por el IACUC.

1. Separación de la presa de Offspring

  1. Seleccione la presa para ser ordeñadas. Elija una presa con una camada de 4 o más crías que es 8-12 días post parto para proporcionar leche máxima de recogida, aunque la colección es posible en cualquier punto después del parto hasta 21 días.
  2. Separe la presa de su camada por lo menos 2 horas antes del ordeño.
    Nota: En caso de un deseo a la leche más de una presa en un determinado período de tiempo, es aceptable para albergar las presas separadas en la misma jaula con una alimentación adecuada y el suministro de agua.

2. La administración de oxitocina, Anestesia y lubricantes para ojos

  1. Administrar 2 UI / kg de oxitocina por vía intraperitoneal (IP). La oxitocina es una hormona que actúa sobre las glándulas mamarias de hembras lactantes para estimular la liberación de la leche. La oxitocina puede ser adquirido from un veterinario.
  2. Administrar una mezcla anestésica que contiene 80-100 mg / kg de ketamina en combinación con 5-10 mg / kg IP xilazina. Por ejemplo, una mezcla de 10 ml de solución madre anestesia se podría preparar con antelación para los ratones con un peso aproximado de 30 g e incluiría 0,1 ml de xilazina, 8,9 ml de H2O y 1,0 ml de ketamina. 0.25 anestésica ml se sedar a un ratón de este tamaño por aproximadamente 20 a 30 min, que debe proporcionar el tiempo adecuado para la recogida de leche.
    Notas: Para determinar que el animal ha sido anestesiado con éxito, coloque suavemente su boca abajo sobre una superficie sólida; ella no debe estar en movimiento sus pies o intentar ponerse de pie si ella está totalmente anestesiado. En el caso de un ratón no está totalmente anestesiado con la dosis original, el investigador puede administrar otra de ¼ o ½ de la dosis original de la mezcla anestésica dependiendo del tamaño del ratón y / o el nivel de sedación que el ratón ya ha alcanzado . Sin embargo, esto podría iaumentar la cant posibilidad de una reacción adversa a la anestesia, y también puede resultar en el ratón está más profundamente anestesiados y / o anestesiado durante un período de tiempo más largo.
    Nota: Si el ordeño más de una presa, es necesario escalonar la oxitocina y las inyecciones anestésicas debido a la corta vida media de la oxitocina y los tiempos de sedación para la ketamina y xilazina.
  3. Aplique una pequeña cantidad de lubricante ocular a la esquina de cada ojo y se extendió a prevenir los ojos del ratón se seque mientras está bajo anestesia.

3. Recogida de Leche

La recogida de la leche se realiza más fácilmente con dos investigadores: un investigador para sostener el ratón anestesiado al tiempo que expresa manualmente la leche (denominado R1), y un investigador para recoger la leche (R2). Este método también se puede realizar con una sola persona, si el ratón está fijado sobre una superficie plana para evitar daño.

  1. R2 debe estar equipado con almohadillas con alcohol estériles, un pip P-200Etman, una punta de pipeta limpia para cada ratón, y un recipiente para contener la leche, tal como un tubo Eppendorf de 1,5 ml o 1,2 ml criovial (véase la Tabla de Materiales).
  2. Como la oxitocina empieza a hacer efecto, bajada de la leche se hará visible en la zona mamaria del ratón (véase la Figura 1 A). R1: Separar una almohadilla con alcohol estéril y frote suavemente la zona mamaria del ratón para limpiar la zona antes del ordeño. Expresar manualmente la leche de la teta utilizando el pulgar y el índice para masajear suavemente y apretar el tejido mamario en un movimiento hacia arriba hasta que una gota visible de la leche empieza a formar en la base de la tetina.
  3. Pulse el Pipetman émbolo P-200 a su primera parada para liberar el aire de la punta de la pipeta y prepararse para la recogida de leche.
  4. Coloque la punta de la pipeta en la parte superior de la gota de leche, y tire suavemente de la leche en la punta de la pipeta al liberar lentamente la presión sobre el émbolo. Tenga cuidado de no poner la punta demasiado cerca del pezón o la piel (verFigura 1B). No es necesario para liberar completamente el émbolo como este se tire de la leche todo el camino hasta la parte superior de la punta de pipeta y hará que sea difícil para expulsar la leche a menudo viscoso en el recipiente de retención.
  5. Expulsar la leche en el contenedor utilizando el pulgar para presionar el émbolo más allá de la primera parada (véase la Figura 1C). Para facilitar la expulsión de pequeños volúmenes, presione la punta de la pipeta contra el lado del tubo, de manera que no se pierda líquido.
  6. Continuar expresar manualmente la leche de cada pezón, moviéndose en sentido horario o en sentido contrario para que no se salte ninguna pezones. Es aceptable y útil para volver y expresar continuamente la leche de la misma teta debería producir más leche que el otro.

4. Reversión anestésico en la presa

  1. En la mayoría de los casos, es común que la presa para empezar a comenzar a despertar durante el proceso de ordeño. Si este no es el caso, coloque la presa en una cage indirectamente por debajo de una fuente de calor, como una frazada que circula calienta, hasta que comienza a despertar.
    Nota: Como la presa comienza a despertar, mantener una estrecha observación de su actividad hasta que ella es capaz de caminar sobre su jaula por su cuenta.
  2. Una vez que la represa se está moviendo alrededor de la jaula sin lucha, colocarla de nuevo en su jaula original con su camada. No hay efectos nocivos se han observado con respecto a la capacidad de las crías a alimentarse después de la recogida de leche.

2. Protocolo de ordeño Muntjac

Los métodos descritos en este protocolo fue aprobado por el IACUC.

1. Separación de los Pérez de Offspring

  1. Seleccione la gama de ser ordeñadas. Ciervos muntjac Reeves general dan a luz a un cervatillo 2. Ordeñar la cierva el día después del parto para permitir la oportunidad cervatillo para ganar acceso a los nutrientes esenciales en el calostro 8.
    Nota: El cervatillo suele ocultar y no vuelve a aparecer durante el procedure; la separación del par madre-descendencia no es necesario.

2. La administración de oxitocina, Anestesia y lubricantes para ojos

  1. Administrar 10 UI / kg de oxitocina por vía intramuscular (IM). La oxitocina es una hormona que actúa sobre las glándulas mamarias de las hembras lactantes para estimular la bajada de la leche. La oxitocina puede ser adquirido de un veterinario.
  2. Administrar el anestésico BAM IM 11 que contiene butorfanol 0,45 mg / kg, azaperona 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Una dosis de la mezcla anestésica BAM sedar un muntjac por aproximadamente 20 a 30 min, que proporciona el tiempo suficiente para la recolección de la leche completa. Otra opción para anestesia es de midazolam en 1-2 mg / kg, que sedar un muntjac de aproximadamente 10-15 minutos. Si bien esto proporciona un tiempo adecuado para la recogida de leche, este anestésico se metaboliza más rápidamente que BAM y el animal pueden intentar escapar al final del período de tiempo más corto.
    Nota: respuesta mínima al dolor, Reflejos menores al tocar los oídos, seguidos por la capacidad de R1 para mantener el MJ sin lucha indica que el animal ha sido anestesiado con éxito.
    Nota: En el caso de un muntjac no está totalmente anestesiado con la dosis original, el investigador puede administrar otra de ¼ o ½ de la dosis original de la mezcla anestésica dependiendo del tamaño del animal y / o el nivel de sedación que ya ha sido alcanzado. Sin embargo, esto podría aumentar la posibilidad de una reacción adversa a la anestesia, y también puede resultar en la muntjac ser más profundamente anestesiados y / o anestesiado durante un período de tiempo más largo.
  3. Aplicar una pequeña cantidad de lubricante a la esquina de cada ojo y propagación para evitar que los ojos del muntjac de la desecación, mientras que bajo anestesia.

3. Recogida de Leche

La recolección de la leche se realiza más fácilmente con dos investigadores; uno de los investigadores para mantener el muntjac anestesiado enla vuelta al tiempo que expresa manualmente la leche (Conocida como R1), y un segundo investigador para mantener la cabeza del muntjac en una posición cómoda y segura y para recoger la leche (R2).

  1. Dependiendo de la anestesia utilizada, el ordeño debe llevarse a cabo ya sea 1) en sus corrales para proporcionar un lugar seguro para ellos en caso de que despierta durante el procedimiento (midazolam-inducida) 2) en una antesala-ropa de cama de forma gratuita o de mantener la limpieza (BAM- inducida).
  2. R1 y R2 deben estar equipados con una gasa empapada en etanol y varios tubos de 15 ml de polipropileno cónicos para mantener la leche.
  3. Como la oxitocina empieza a hacer efecto, bajada de la leche se hará visible en la zona mamaria del muntjac. R1: Desinfectar las manos y los dedos enguantados, así como toda la ubre y cada pezón individual del animal con la gasa empapada en etanol. R2: Sostenga la cabeza del muntjac en una posición segura y cómoda para permitir la facilidad de la respiración y ayudar a prevenir la regurgitación rumen. Mantenga los cl tubo de recogida OSE al pezón ordeñada sin tocarlo para evitar la contaminación potencial.
  4. Extraiga la leche de un pezón con los dedos pulgar e índice para apretar suavemente el tejido mamario en un movimiento hacia arriba hasta que el pezón se hincha con la leche, y rodar suavemente la leche del pezón y en el tubo que R2 está llevando a cabo (véase la Figura 2 ).
  5. Nota: La leche sale en un arroyo, por lo que es importante para el R2 para que el tubo de extracción colocado de manera que poco o nada de leche será en vano.
  6. La ubre de la muntjac se divide en cuadrantes. R1: Continuar para expresar la leche de cada cuadrante hasta que la leche ya no fluye fácilmente. Si la leche no se puede expresar de una teta, expresa de todas las otras tetinas antes de regresar a la primera. Es aceptable y útil para volver y expresar continuamente la leche de la misma teta debería producir más leche que el otro.

4. Inversión de anestésico en el DOE

t "> Es común que doe inducida midazolam-para empezar a despertar durante el proceso de ordeño. En la mayoría de los casos, la cierva intentará escapar antes de que toda la leche se ha expresado. moderación Minor se utiliza en un esfuerzo por aumentar la leche rendimiento; sin embargo, la seguridad y el confort tanto de los investigadores y la hembra son igualmente importantes.

  1. Administrar atipamezol a 2,5 mg / mg medetomadine subcutánea para la rápida reversión de BAM anestesiado doe.
    Nota: Con ambos tipos de anestesia, es necesario mantener una estrecha observación de la hembra hasta que ella es capaz de caminar por sí misma sin tropezar o caer, y es capaz de comer y beber sin temor a la aspiración o atragantamiento. No hay efectos nocivos se han observado con respecto a la capacidad del cervatillo para amamantar después de la recogida de leche.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Ratón

Desde nuestros experimentos, hemos determinado que es posible recoger aproximadamente 100-400 l de leche de un ratón de laboratorio, dependen de diversas variables. Estas variables incluyen: 1) la cantidad de tiempo dedicado a la recolección, 2) la dosis de oxitocina administrada, 3) el número de crías de la presa es actualmente de enfermería y 4) el importe de la post parto vez. Nuestros estudios han demostrado que se obtiene el máximo rendimiento cuando las presas so...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Ratón

Hay varios factores a tener en cuenta en la recogida de leche de un ratón, incluyendo 1) la cantidad de tiempo dedicado a la recolección, 2) la dosis de oxitocina administrada, 3) el número de crías de la presa es actualmente de enfermería y 4) la cantidad de tiempo que ha pasado desde el parto en el momento de la recolección. A partir de estudios anteriores como guía, nos dispusimos a optimizar las condiciones para la producción de leche.

...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estos experimentos fueron financiados por la subvención de los NIH #RAI093634A. Expresamos nuestra inmensa gratitud a Jenny Powers, DVM, PhD, por su ayuda en el ordeño de muntjac.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales—
Ketamina de ratón (KetaVed 100 mg/ml) (dosis: 80-100 mg/kg)MWI/Vedco011075
Xilacina (TranquiVed 100 mg/ml) (dosis: 5-10 mg/kg)MWI/VedcoNADA 139236
Lubricante ocularMWI/Apexa701013
Oxitocina (2 UI/kg)Vet One501013
Materiales— Muntjac
Midazolam (1-2 mg/kg)Amerisource Bergen Drug Corp924326Opcional: el investigador puede usar Midazolam solo o en combinación de BAM como anestésico
Tartrato de butorfanol (Torbugesic) (0,45 mg/kg)Fort Dodge Animal HealthNADA 135-780
Tartrato de azaperona (0,25 mg/kg)ZooPharm
Medetomadina HCl (0,07 mg/kg)ZooPharm
Clorhidrato de antipamezol (Antisedán) (dosis: 0,25 mg/kg)Orion CorporationNADA 141-033
Oxitocina (10 UI/kg)Vet One501013
Equipo— Ratón
P-200 PipetmanGilson F123601
200 μ l puntas de pipetaLight LabsB-2004-SH
jeringas de 1 mlMWI005427
agujas de 27 GMWI002031
Equipo— Muntjac
15 ml tubos cónicosVWR21008-918
agujas de 22 gMWI873
jeringas luer lock de 3 mlMWI001377

Referencias

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Modelo de rat nadministraci n de oxitocinaprocedimiento de anestesiaexpresi n manualpipeta P 200tubos de recolecci n est rilesmasaje del tejido mamariorecuperaci n de la seguridad animal

Artículos relacionados