Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Resumen

Este video muestra una estrategia fácil y confiable para la preparación de cultivos puros de células endoteliales del cerebro anterior embrionario dentro de 10 a 12 días y será útil para la investigación se centró en muchos aspectos de la angiogénesis cerebral.

Resumen

Células endoteliales cerebrales embrionarias pueden servir como una herramienta importante en el estudio de la angiogénesis y el desarrollo neuro-vascular y las interacciones. Las dos redes vasculares del cerebro anterior embrionario, pial y periventricular, son espacialmente distintivo y tienen diferentes orígenes y patrones de crecimiento. Las células endoteliales de las redes vasculares pial y periventriculares tienen perfiles de expresión de genes únicos y funciones. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el aislamiento, la cultura, y la verificación de las poblaciones puras de células endoteliales de la red vascular periventricular (PVECs) del cerebro anterior embrionario (telencéfalo). En este enfoque, telencéfalo desprovisto de membrana de la pía madre obtenido a partir de día embrionario 15 ratones se pica, se digirió con colagenasa / dispasa, y se dispersa mecánicamente en una suspensión de células individuales. PVECs se purificaron a partir de la suspensión celular utilizando selección positiva con el anticuerpo conjugado con microperlas anti-CD-31/PECAM-1 usando un fuerte magnéticamétodo de separación. Las células purificadas se cultivan en placas de cultivo de colágeno 1 recubiertas en medio de cultivo de células endoteliales hasta que se vuelven confluentes y más subcultivado. PVECs obtiene con este protocolo de adoquines de exposiciones y fenotipos en forma de huso, como se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. Pureza de los cultivos PVEC se estableció con marcadores de células endoteliales. En nuestras manos, este método produce de forma fiable y consistente poblaciones puras de PVECs. Este protocolo se beneficiarán los estudios dirigidos a la obtención de conocimientos sobre mecánica en angiogénesis cerebro anterior, la comprensión de las interacciones PVEC y cruzadas las conversaciones con los tipos de células neuronales y tiene un enorme potencial para angiogénesis terapéutica.

Introducción

La angiogénesis, la neurogénesis y la migración neuronal son eventos críticos en el sistema nervioso central (SNC) el desarrollo, la reparación y la regeneración. Varios estudios elegantes han demostrado que las células endoteliales estimula la proliferación neuronal y viceversa a través de la liberación de factores solubles y por contacto directo. Encontramos curioso que en la mayoría de estos estudios ^1-3, mientras que progenitoras neuronales células madre neurales / están aislados del cerebro embrionario, que se co-cultivaron con células endoteliales del cerebro adulto, otras fuentes de tejidos adultos, o con líneas de células endoteliales. Esto podría ser en parte debido a las dificultades técnicas asociadas con el aislamiento y el cultivo de poblaciones puras de células endoteliales del cerebro embrionario. Sin embargo, la angiogénesis, la neurogénesis, y la migración neuronal son eventos concurrentes que ocurren en órdenes de magnitud más robusto en el cerebro embrionario que en el cerebro adulto normal. La red vascular periventricular del embryonic cerebro anterior (telencéfalo) se origina a partir de un recipiente situado en el primordio ganglios basales y se desarrolla en la forma de un gradiente ordenada de ventral a dorsal telencéfalo por día embrionario 11 (E11) de ^4,5. Este plexo de vasos de la red vascular periventricular son distintos de los buques de pial basada en orígenes, localización anatómica, patrones de crecimiento y regulación del desarrollo ^4,5. La dirección de propagación de la pendiente de la angiogénesis periventricular coincide con el gradiente transversal neurogenetic telencephalic. Dentro del telencéfalo, el gradiente de la angiogénesis periventricular y el gradiente de las neuronas GABA que migran tangencialmente superpone espacialmente y ^6. Con respecto a la sincronización, el gradiente de la angiogénesis es antes de la pendiente y de la neurona de GABA gradiente neurogenético en aproximadamente un día. Así, las células endoteliales periventriculares son espacial y temporalmente en buena posición para proporcionar señales vitales para ayudar en la neurogénesis y telencephalic^4,6 migración neuronal. Por lo tanto, el uso de células endoteliales periventriculares embrionarias en experimentos de cocultivo con células progenitoras y / o neuronas neuronales proporcionaría un modelo más favorable para el estudio de interacciones neurovasculares y el desarrollo de nuevas vías para el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa o una lesión cerebral isquémica / traumática.

Hacemos hincapié en la importancia de eliminar la membrana pial, no sólo para limitar la contaminación de las células epiteliales, sino también para separar las células endoteliales pial que son molecularmente y funcionalmente distinta de las células endoteliales de la red vascular periventricular ^4,6 (PVECs denominados de distinguir de pial EC) . Aquí se describe el método que utilizamos habitualmente en nuestro laboratorio para obtener un rendimiento rica y pura de PVECs. Estas células endoteliales se preparan a partir de prosencéfalos embrionarios aislados a partir de un solo ratón temporizado-embarazada. Se pueden expandir, subcultivaron, y congelaron con éxito para su uso futuro.

Protocolo

1. Preparación de los reactivos y soluciones

1. El recubrimiento de 35 mm de placa de cultivo: Colágeno Tipo 1 solución se suministra como una solución acuosa en 20 mM de ácido acético (~ proteína de 100 mg / vial). Diluir un volumen apropiado de solución de colágeno a una concentración de trabajo de 0,01% usando agua de calidad de cultivo de tejido estéril. Platos capa con 1 ml de solución de colágeno durante 3-4 horas a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la noche a 2-8 º C. Retire el exceso de solución de la placa recubierta y deje que se seque durante la noche. Enjuague el recipiente con agua de calidad de cultivo de tejidos o PBS antes de la adición de medios de comunicación. Placas revestidas se pueden almacenar a 4 ° C durante un mes.
2. Preparar medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM). Complementar la DMEM (500 ml) con 10% de FBS y solución de antibiótico-antimicótico (concentración 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo se puede almacenar a 4 ° C durante dos meses.
3. Prepare una parte alícuota (50 ml) de DMEM con DNasa I (0,001 mg / ml), (a que se refiere como DMEM-DNasa I).
4. Preparar otra alícuota (10 ml) de DMEM con colagenasa y dispasa (1 mg / ml) (referido como DMEM-collagenase/dispase).
5. Preparar endotelial medio de cultivo celular (ECCM, 500 ml), suplementado con EGF (5 g), DE ECG (100 mg) y 5 l de solución de antibiótico-antimicótico. ECCM se puede almacenar a 4 ° C durante dos meses.
6. Precalentar todos los medios de comunicación antes de su uso.
7. Preparar tampón de purificación: PBS, pH 7.2 con 0.5% BSA y 2 mM de EDTA. Mantener tampón frío (2-8 ° C).

2. La eliminación de los embriones y la disección de Telencéfalo

Todos los experimentos con animales de laboratorio han sido aprobados por los comités de cuidado y uso de animales de Hospital McLean y se ajustan a las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Utilice ratones CD1 embarazadas cronometrados (día embrionario 15). El día del descubrimiento tapón vaginal se considera el día embrionario 0 (E0). Presas CD1 generalmente producen camadas grandes, por lo que 10 a 12 embrioness se espera de una presa embarazada.
2. Para histerotomía, anestesiar a los ratones embarazadas con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg). Para los ratones aproximadamente 20-30 g, entregar 0,3 ml de una solución anestésica 10 ml / kg de ketamina / xilazina y asegurarse de que el dolor y la angustia es mínima durante las inyecciones intraperitoneales de la anestesia. Utilice la restricción de mano para las inyecciones.
3. Compruebe anestesia profunda por pizca dedo del pie. Retire los embriones de los ratones anestesiados profundamente. Decapita a cada embrión inmediatamente después de retirarlos de la madre. Coloque las cabezas de embriones en placas de Petri estériles en hielo frío PBS.
4. Siga la histerectomía por eutanasia inmediata con sobredosis de anestesia (130 mg / kg de pentobarbital, IP), un método para la eutanasia, que es coherente con las Directrices AVMA de eutanasia de Animales: 2013 Edition.
5. Bajo un microscopio estereoscópico, retire el cerebro de la cabeza con unas tijeras MicroTip finas y unas pinzas finas. Nota: Una disección de alta calidadion es esencial para eliminar con éxito la membrana de la pía madre del cerebro embrionario. Esto se logra mediante la práctica. Bellas pinzas y tijeras MicroTip también son herramientas clave para conseguir una buena disección.
6. Utilice las pinzas para obtener un firme control sobre el cerebro y las tijeras MicroTip para despegar la membrana pial. Retire el mesencéfalo y metencephalon y aislar el telencéfalo. Traslado telencéfalo-pial libre de todos los embriones a una placa de cultivo de 35 mm con 2 ml de PBS en hielo.

3. El aislamiento de la célula

1. Picar el telencéfalo en fragmentos de 1-2 mm con una hoja de bisturí y recoger el tejido en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 2 ml de DMEM completo.
2. Disociar el tejido suave pero completamente con una pipeta de 1 ml hasta grumos desaparecen y se consigue una suspensión lechosa.
3. Centrifugar las células disociadas a 800-1.000 xg durante 5 min a TA.
4. Retire con cuidado el sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en DMEM-DNasa I. suavemente disociar la ceLLS de nuevo utilizando 1 ml de la pipeta y se centrifuga a 800-1.000 xg durante 5 min a TA.
5. Resuspender el precipitado en caliente DMEM completo. Las células de filtro a través de una malla de nylon de 70 micras estéril. Recoger las células filtradas y mantenerse en hielo.
6. Recoge las proporciones de células retenidas en la malla y digerir más con DMEM-collagenase/dispase (2 ml) durante 1-2 minutos a temperatura ambiente. Lavar las células 3 veces en DMEM-DNasa I a través de centrifugación a 800-1.000 xg durante 5 min a TA. Reunir estas células con las células filtradas recogidos en el paso 3.5. Lavar las células una vez con un total de DMEM completo. Procederá a determinar el número de células y medidas de etiquetado magnéticos. Nota: Es importante para obtener una suspensión de células individuales antes de su etiquetado magnético.

4. Etiquetado magnético

1. Este protocolo muestra el etiquetado magnético de 10 ⁷ células. Para el número de células inferior a 10 ^7, utilice el mismo volumen de reactivo y para el número de células mayor que 10 ^7, la escala de todos los volúmenes de reactivo y el volumen totalen consecuencia (por ejemplo, para 2 x 10 ⁷ células totales, utilizar dos veces el volumen de todos los reactivos indicados). Mantenga todos los reactivos y las células en hielo.
2. Determinar el número de células con un hemocitómetro.
3. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 10 min a TA. Aspirar el sobrenadante por completo.
4. Añadir 90 μl/10 ⁷ células de tampón de purificación para el sedimento de células seguido de 10 l de microperlas CD31. Los Microbeads proporcionadas por el fabricante se conjugan al anticuerpo monoclonal anti-CD31 de ratón.
5. Mezclar bien e incubar durante 15 min en la nevera. Nota: Las temperaturas más altas y / o un mayor tiempo de incubación durante etiquetado magnética pueden dar lugar a la unión no específica.
6. Lavar las células mediante la adición de 1-2 ml/10 ⁷ células de tampón de purificación y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retire las células sobrenadante y resuspender en 500 l de tampón de purificación. Proceder a la separación magnética o etapa de purificación.

5. Purificación

1. Colocar la columna de la EM en el campo magnético del separador MACS.
2. Enjuague la columna con 500 l de tampón de purificación.
3. Aplicar la suspensión celular en la columna. Carga número apropiado de células a la columna de MS como el número de células más alta puede obstruir la columna. Precaución: Cada columna MS puede acomodar a un número máximo de 2 x 10 ⁷ celdas, para un número mayor de células, utilizar más columnas.
4. Recoger y desechar de flujo continuo que contiene células no marcadas.
5. Lavar la columna con 500 l de tampón de purificación tres veces. Durante las etapas de lavado, asegúrese de que el depósito de la columna esté vacía antes de la adición de alícuotas sucesivas tampón de purificación.
6. Retire la columna del separador de MACS y colocarlo en un tubo Falcon de 15 ml.
7. Un émbolo se suministra junto con la columna de la MS. Pipetear 1 ml de tampón de purificación en la columna de la MS y de inmediato a eliminar las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna.
8. Cel Platels en una placa de cultivo de 35 mm recubierto previamente con colágeno de tipo 1 y crecer las células en ECCM en una incubadora a 37 ° C con 95% de _O2 y 5% de CO _2.
9. Cambiar el medio cada cuatro días. Utilice PVECs para experimentos o subcultura después de 10-12 días cuando el plato es confluente.

6. Subcultura de PV ECS

1. Retire el CCME y enjuague la monocapa de PVECS con 1-2 ml de PBS estéril.
2. Añadir con cuidado 1,5 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% para cubrir la monocapa de células.
3. Devuelva el plato a la incubadora. Dentro de 5-7 minutos, las células se separará de la superficie del plato.
4. Después las células se han separado, añadir inmediatamente un volumen igual de inhibidor de la tripsina y se tritura varias veces.
5. Transferir las células a un tubo Falcon de 15 ml estéril. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 5 min.
6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de precalentado ECCM.
7. Sembrar las células para la expansión de la cultura, el imenvejecimiento u otros ensayos.

Resultados

La caracterización fenotípica de PVECs de días 1-12 se muestra con contraste de fase microscopía de luz (Figura 2). Las células unidas a la placa en el día 1 muestran la morfología característica de la división celular (Figura 2A). Entre 5-8 días, PVECs transición de la piedra del adoquín de husillo morfología en forma típica de las células endoteliales y más afín a su estado in vivo (Figuras 2B y 2C). Durante el día 12 la cultura PVEC logre la...

Discusión

De PVEC son fisiológicamente más relevantes de adultos células endoteliales cerebrales y EC de otras fuentes de tejidos para estudios que se centran en las interacciones neurovasculares y también tienen un potencial terapéutico. Para la preparación PVEC, es principio fundamental con la disección que trabajar rápido para lograr una buena viabilidad ya que las células muertas se pueden unir de forma no específica a microperlas CD31. Además, si la suspensión de una sola célula no se consigue antes de la etapa de marcaje ma...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DNasa I	Sigma	D-4527
Colágeno, solución tipo 1 de cola de rata	Sigma	C3867
Productos biológicos de calidad DPBS		114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
Columna MS	Miltenyi Biotech	130-042-201
Microperlas CD31	Miltenyi Biotech	130-097-418
Separador MACS	Miltenyi Biotech	130-042-102
MACS multi stand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Filtro de células 70 µ m	BD Biociencia	352350
Solución antibiótica y antimicótica	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
Colagenasa/Dispasa	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
Plato de cultivo de 35 mm	BD Bioscience	353001
Tubo de halcón de 15 ml	BD Bioscience	352097
Tubo Falcon de 50 ml	BD Bioscience	352098
Kit ECCM	BD Bioscience	355054	kit Incluye suplemento de crecimiento de células endoteliales, EGF y suplemento de
crecimiento de células endoteliales (ECGS)	Bioscience	354006
Aplicaciones de celda	RBECGM	R819-500
DMEM F12	Tecnologías de la Vida	10565-018
Tecnologías de vida GlutaMAX		305050-061
Agua de grado de cultivo de tejidos	Life Technologies	15230162
0.25% Tripsina Life	Technologies	15050
Inhibidor de tripsina de soja	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 Kit de etiquetado de celdas Life Technologies		Q25021
Membrana plasmática CellLight-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
Anticuerpo de isolectina B4 biotinilado	Sigma	L2140
Factor anti-Von Willebrand	Sigma	F3520
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
Medios de montaje rígidos VECTASHIELD con DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Ketamina	Butler Schein Suministro de Salud Animal	44028
Xilacina	Lloyd Laboratories	1009
Microscopio estereoscópico	Motic	SMZ-168
Hemocitómetro	Fisher Scientific	267110
Microscopio invertido	Olympus CK-40	CK-40
Microscopio fluorescente	Olympus FSX-100	FSX-100
Pinzas finas	Roboz Surgical Instrument	7 inox
Tijeras de micropunta fina	Roboz Surgical Instrument	RS5611

inhibidor de tripsina de sojaBD