Se describe aquí un fluorescencia simple en la hibridación in situ (FISH) método para la localización de virus y bacterias en los tejidos de insectos y plantas. Este protocolo se puede ampliar para la visualización de mRNA en todo el montaje y secciones microscópicas.
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Resumen
Resumen
Fluorescencia de hibridación in situ (FISH) es un nombre dado a una variedad de técnicas comúnmente usadas para la visualización de las transcripciones de genes en células eucarióticas y se pueden modificar adicionalmente para visualizar otros componentes en la célula tales como la infección por virus y bacterias. Localización espacial y la visualización de los virus y bacterias durante el proceso de infección es un paso esencial que se complementa con los experimentos de perfiles de expresión como los microarrays y RNAseq en respuesta a diferentes estímulos. La comprensión de las infecciones espacio-temporales con estos agentes complementa experimentos biológicos destinados a la comprensión de su interacción con los componentes celulares. Varias técnicas para la visualización de virus y bacterias tales como sistemas de genes informadores o métodos inmunohistoquímicos son mucho tiempo, y algunos se limitan a trabajar con organismos modelo e implicar metodologías complejas. FISH que se dirige a especies de ARN o de ADN en la célula es una me relativamente fácil y rápidoDTO para el estudio de la localización espacio-temporal de los genes y para fines de diagnóstico. Este método puede ser robusto y relativamente fácil de implementar cuando los protocolos de hibridación emplean corto, sondas comercialmente comprados-, que no son caros. Esto es particularmente robusta cuando preparación de la muestra, la fijación, la hibridación, y la visualización microscópica no implican pasos complejos. Aquí se describe un protocolo para la localización de las bacterias y los virus en los tejidos de insectos y plantas. El método se basa en una preparación simple, la fijación, y la hibridación de montajes completos de insectos y órganos diseccionados o secciones de plantas hechas a mano, con 20 pares de bases de las sondas de ADN cortos conjugados con tintes fluorescentes en sus 5 'o 3'. Este protocolo se ha aplicado con éxito a un número de tejidos de insectos y plantas, y puede ser utilizado para analizar la expresión de ARNm o de otras especies de ARN o ADN en la célula.
Introducción
Cuando el estudio de las interacciones entre los virus de plantas y otros patógenos con sus huéspedes vegetales infectados, es importante visualizar los patógenos y sus respectivos ácidos nucleicos in situ, sin tener en cuenta si causan efectos negativos en sus anfitriones. Esto es más importante cuando se estudia el movimiento del patógeno dentro y entre las células de la planta. En localización in situ de productos de los genes del patógeno es un paso esencial que complementa otros enfoques para estudiar el proceso de patogenicidad. Muchos patógenos de las plantas, especialmente virus, son transmitidas por insectos, tener interacciones complejas e íntimas con sus vectores. La localización de estos virus en sus vectores es importante para el estudio de la ruta de acceso para la transmisión, y los posibles sitios de interacción dentro del vector. La transmisión de algunos virus de plantas por insectos es ayudado por las bacterias endosimbiontes que residen dentro de estos insectos. Para estudiar mejor la transmisión de estos virus de plantas by sus vectores, sino que también es esencial para visualizar las bacterias endosimbiontes en general, y los que participan en la transmisión del virus, en particular. Colocalización de los virus bacterias y endosymbiotic este modo deseado para investigar las posibles relaciones entre estos organismos dentro de su insecto hospedador. Aparte de la transmisión del virus, bacterias endosymbiotic influyen varios aspectos de la biología de los vectores de insectos, por lo tanto la localización espacial de estas bacterias dentro de insectos es de gran interés e importancia.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) es el complejo de la enfermedad viral más importante del tomate cultivado en todo el mundo 1-4. TYLCV es un virus floema limitado y recibe guía vectorial exclusivamente por la mosca blanca Bemisia tabaci 5,6. Un modelo que describe la translocación de begomovirus en sus vectores de mosca blanca se ha propuesto 6-9. Dos barreras específicas se cruzan de forma activa duranteing esta transmisión circulativa: el intestino medio / hemolinfa y las barreras de la glándula hemolinfa / salivales. Este proceso de transmisión se planteó la hipótesis de que es mediado por los receptores desconocidos que reconocen la cápside del virus. TYLCV se piensa para cruzar B. tabaci intestino medio de 6,10, y se absorbe a través de la glándula salival primaria 6 antes de que se inyecta en la planta. En la hemolinfa de la mosca blanca, TYLCV interactúa con una proteína GroEL producida por la bacteria endosimbiótica secundaria insecto Hamiltonella. Esta interacción garantiza un transporte seguro del TYLCV en la hemolinfa, y lo protege del ataque por el sistema inmune de insectos 11. Hamiltonella y Portiera, la endosymbiont primaria de la mosca blanca, se alojan en bacteriocytes, células de insectos que se encuentran en la hemolinfa y la casa endosymbiotic bacterias 11. B. tabaci alberga bacterias endosimbiontes adicionales como Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, y Fritschea, que pueden ser localizados dentro o fuera de los bacteriocytes, y tienen diversos efectos sobre la biología del insecto 12.
Varios informes han intentado estudiar la localización del TYLCV en plantas y moscas blancas mediante el uso de protocolos consumen mucho tiempo y costosos tales como Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), anticuerpos y ARN in situ sobre la sección de espesor microscópico 10,13, un estudio reciente describió la localización de virus de plantas dentro de sus plantas hospederas y vectoriales usando un simple protocolo 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la localización de TYLCV en B. tabaci diseccionó midguts y las glándulas salivales, y en las secciones prepara a partir de plantas infectadas por el virus de la cuchara. Se describe además la localización de Portiera, el endosymbiont principal de B. tabaci, y sus endosimbiontes secundarios Hamitonella, Rickettsia y Arsenophonus. Este protocolo se basa en el uso de sondas de ADN cortos, quese etiqueta fluorescente en su extremo 5 ', y hibridarse específicamente a secuencias complementarias en las secuencias de genes virales o bacterianas. El procesamiento de la muestra es relativamente fácil y la señal obtenida es altamente específico. El protocolo descrito se puede utilizar para localizar virus, bacterias y otros patógenos en sus huéspedes vegetales, animales y de insectos, y se puede usar además para localizar ARNm en cualquier tejido dado.
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Protocolo
1. General de la Mosca Blanca, planta y virus Preparativos para el análisis FISH
- B y Q trasero mosca blanca biotipo sobre plántulas de algodón (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) y mantener el interior de las jaulas a prueba de insectos y cámaras de crecimiento en condiciones estándar de 25 ± 2 ° C, humedad relativa del 60%, y una luz de 14 horas / 10-hr fotoperíodo oscuro.
- Realizar PCR para probar la infección con endosimbiontes utilizando primers específicos endosimbiontes como se describió previamente 15-19.
- Compra plántulas de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) de un vivero comercial o semillas de tomate de la planta.
- Mantener en las mismas condiciones de cría descritas anteriormente hasta que las plantas alcanzan la etapa de cuatro hoja verdadera, la edad más adecuada para la inoculación mosca blanca-mediada de TYLCV 15 (véase la sección 4.1 más adelante).
2. Manejo de Insectos, Fijación, Sonda Diseño, hibridación y visualización de EndoFISH simbionte
- Recoge 10 moscas blancas adultas mediante aspiración de plantas de algodón, o recoger 10 3 ª o 4 ª ninfas de las hojas de algodón.
- Sumerja inmediatamente en fijador de Carnoy (ácido cloroformo-etanol-acético glacial, 06:03:01, vol / vol) en el interior de tubos de Eppendorf. Fijar durante 2 horas a toda la noche (preferiblemente durante la noche).
- Eliminar completamente el fijador y decolorar en 6% de H 2 O 2 en etanol durante 2 horas.
- Conservar las muestras en etanol absoluto durante varios días a varias semanas a temperatura ambiente, o proceder con el siguiente paso.
- Sondas diseñar cebadores de ADN inversa como complementarios basados en los 16s genes de ARN ribosomal de cada bacteria. Para el diseño de las sondas, tener en cuenta las mismas consideraciones para el diseño de cebadores de PCR. Utilice las sondas de oligonucleótidos BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Rb1 Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-BTH-Cy3 CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'y 5'-ARS2 cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'para la orientación específica de Portiera, Rickettsia, Hamilonella y Arsenophonus, respectivamente.
- Hibridar muestras durante la noche en la oscuridad en tampón de hibridación (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,9 M, 0,01% [/ vol en peso] de sodio dodecil sulfato, 30% [vol / vol] formamida) que contiene 10 pmol de sonda fluorescente por ml . Combinar más de una sonda con diferentes colorantes fluorescentes si es necesario. Utilice la mosca blanca no infectados con la bacteria específica y muestras sin sonda como controles negativos.
- Montar las muestras de conjunto, en un portaobjetos, en tampón de hibridación que figura con un bloqueador de líquido, cúbralo con una hoja de cubierta, sellar con esmalte de uñas, y la vista bajo una fluorescencia o un microscopio confocal.
3. Mosca Blanca Organ Disección, fijación, hibridación y visualización para FISH TYLCV
- Recoger las moscas blancas adultas han criado permanentemente en plantas de tomate infectadas con virus de la cuchara por aspiración y anesthetize por la exposición a una toalla de papel impregnada con acetona. Exponga las moscas blancas sólo durante 1-2 minutos como mucho tiempo de exposición a la acetona puede arreglar tejidos moscas blancas. Utilice la mosca blanca nonviruliferous criados en plantas de tomate infectadas y no hay muestras de la sonda para los controles para confirmar la hibridación específica.
- Mount moscas blancas en microscopio diapositivas de la depresión para la disección de órganos utilizando un microscopio estereoscópico.
- Extraiga la cabeza del insecto del protórax y diseccionar las glándulas salivales en 1x PBS suplementado con 1% de azul de toluidina mancha para una mejor visualización, debido a su pequeño tamaño. Permitir la absorción de la mancha durante 2-3 min.
- Tire del insecto aparte en la unión entre el tórax y el abdomen para observar y expulsar el intestino medio. Expulsar a los contenidos del abdomen, empujando con pinzas en la punta del abdomen.
- Retire suavemente el PBS y el azul de toluidina de disecciones de éxito y agregar suavemente 300 l de fijador de Carnoy para fijar los órganos durante 5 min.
- Ladd fijador de un lado del pozo depresivo y no de arriba para evitar el movimiento incontrolado de los órganos diseccionados. Una vez tocar el fijador, los órganos se adhieren al vidrio, y durante todo el proceso que no se muevan.
- Eliminar fijador y añadir 500 l de tampón de hibridación suplementado con 10 pmol de la sonda de ADN fluorescente Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', que es complementaria a una secuencia en el gen de TYLCV proteína de la cubierta.
- Hibridar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad incubando el portaobjetos con la muestra en el interior una pequeña cámara húmeda compuesta de pequeña caja de plástico con papel toalla mojada en la parte inferior.
- Después de la hibridación, recoger a los órganos con una herramienta de disección fina y rápidamente moverlos a un portaobjetos de microscopio fresco que contiene 30 l de tampón de hibridación nueva suplementadas con DAPI (0,1 mg / ml en PBS 1x) y contenidos con bloqueador de líquido.
- Cubra las muestras con una hoja de cubierta, sellar el ingenioesmalte de uñas y la vista h bajo una fluorescencia o un microscopio confocal.
4. Manejo de Plantas, Mano-seccionamiento, Fijación, e hibridación para FISH TYLCV
- Se inoculan las plántulas de tomate con TYLCV usando viruliferous inoculación mosca blanca mediada. El virus puede ser detectado utilizando este método FISH en plantas asintomáticas una semana después de la inoculación. Los síntomas típicos de la enfermedad son visibles tres semanas después de la inoculación. Utilice plantas de tomate no infectados y no hay muestras de la sonda para los controles para confirmar la hibridación específica.
- Utilice una hoja de afeitar afilada histológico para preparar 2-4 secciones largas cm cortadas a mano longitudinales o transversales de tomate tallos y hojas.
- En tubos Eppendorf, fijar las secciones en fijador de Carnoy durante 2 horas a toda la noche a temperatura ambiente.
- Quite el fijador y preservar las secciones en etanol absoluto durante varios días a varias semanas a temperatura ambiente, o proceder con el siguiente paso.
- Lavar las seccionestres veces, 1 min cada uno, en tampón de hibridación.
- Hibridar las secciones con 500 l de tampón de hibridación suplementado con 10 pmol de la sonda de oligonucleótido fluorescente Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'que es complementaria a una secuencia en el gen de TYLCV proteína de la cubierta.
- Lávese las secciones tres veces, 1 min cada uno, en tampón de hibridación.
- Mount secciones enteras en tampón de hibridación suplementadas con DAPI (0,1 mg / ml en PBS 1x) y contenidos con bloqueador de líquido, cubrir con un cubreobjetos, sellar con esmalte de uñas y la vista bajo una fluorescencia o un microscopio confocal.
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Resultados
El sistema estudiado en este manuscrito se muestra en la Figura 1 e incluye una planta infectada con virus de la cuchara, un adulto y una ninfa de la mosca blanca B. tabaci, y la anatomía interna de la mosca blanca que muestra la trayectoria de la translocación TYLCV en el insecto. Figura 2 muestra dos peces en un mosca blanca adulta para el simbionte primario Portiera y el simbionte secundaria. Arsenophonus Figura 3 muestra doble FISH para
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Discusión
El protocolo descrito aquí para la localización de un virus de planta en su huésped de la planta y los insectos vectores, y las bacterias endosymbiotic en su huésped de la mosca blanca específica, se puede adaptar para la localización de otros virus en plantas e incluso en los tejidos animales. Además, el protocolo se puede utilizar para localizar bacterias endosymbiotic y patógenos y otros microorganismos en sistemas de plantas y animales. Los métodos descritos se basan en el concepto simple de la hibridación entre una...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación en el laboratorio de Ghanim fue apoyado por una beca de investigación no. 908-42.12/2006 de la Fundación alemana-israelí (GIF), concesión no. IS-4062-07 de la-Unidos Israel Fund Estados Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (BARD), y la beca de investigación no. 884/07 de la Israel Science Foundation (ISF) de MG
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Marcado con fluorescencia Sondas | Metabion | 20 bp HPLC purificado | Secuencia diseñada por el cliente |
| Azul de toluidina | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Dodecil Sulfato de Sodio | Sigma-Aldrich | L3771 | Grado de Biología Molecular |
| Formamida | Sigma-Aldrich | F9037 | Grado de Biología Molecular |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Grado de Biología Molecular |
| Ácido acético glacial | Sigma-Aldrich | 320099 | Bloqueador líquido de grado de biología molecular |
| Ted Pella Inc. | 22309 |
Referencias
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
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