Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.
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Artículo de método
Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de
En este artículo
Resumen
Resumen
Drosophila melanogaster es un sistema modelo de gran alcance que ha sido ampliamente utilizado para dilucidar una variedad de procesos biológicos. Por ejemplo, los estudios tanto de la mujer y las líneas germinales masculinas de Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la meiosis, así como la biología de células madre. Excelente protocolos están disponibles en la literatura para el aislamiento y formación de imágenes de los ovarios y los testículos 3-12 de Drosophila. En la presente memoria, los métodos para la disección y preparación de testículos de Drosophila para el análisis microscópico se describen con una demostración de vídeo adjunto. Un protocolo para el aislamiento de los testículos del abdomen de los hombres adultos y preparar diapositivas de tejido vivo para el análisis por microscopía de contraste de fase, así como un protocolo para la fijación y la inmunotinción testículos para el análisis por microscopía de fluorescencia se presentan. Estas técnicas se pueden aplicar en la caracterización de mutantes de Drosophila que exhiben defects en la espermatogénesis, así como en la visualización de localizaciones subcelulares de las proteínas.
Introducción
Testículos de Drosophila son un sistema modelo ideal para el estudio de muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de células madre, la meiosis, y el desarrollo del esperma 13-18. Los espermatocitos y sus husos meióticos son grandes y por lo tanto, conveniente para el análisis citológico, y los puntos de control del ciclo celular relajado durante la espermatogénesis facilitar el estudio de mutaciones en los genes del ciclo celular. Diferentes tipos de células se pueden observar en la progresión ordenada a lo largo de la longitud de los testículos, y cualquier interrupción de la espermatogénesis pueden conducir a cambios en esta disposici....
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Protocolo
1. Testículos Disección
- Anestesie moscas en una botella o frasco con una corriente de CO 2 y la transferencia a una almohadilla de mosca.
- Ordenar moscas bajo un microscopio de disección usando un pequeño pincel, y recoger un número apropiado (dependiendo del experimento) de los machos de Drosophila de los genotipos deseados. Los hombres jóvenes (0-2 días de edad) son ideales para el examen de las células a través de las primeras etapas de la espermatogénesis (por ejemplo espermatogonias, espermatocitos y espermátidas tempranas post-meióticas), mientras que los machos ligeramente mayores (2-5 días de edad) son ideales ....
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Resultados
Un ejemplo de un par adecuadamente diseccionado de los órganos reproductores masculinos de Drosophila se muestra en la Figura 2A. Testículos retirados desde el abdomen de la mosca macho adulto están típicamente unidos al conducto eyaculador (marrón, Figura 2A ') y un par de glándulas accesorias (verde, Figura 2A') a través de un par de vesículas seminales (azul, Figura 2A ') . Para separar los testículos de la mayor parte del tejido.......
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Discusión
Aunque los testículos de los de tipo salvaje moscas pueden ser fácilmente identificados por su color amarillo (a diferencia de los tejidos blancos vecinos), los testículos de las moscas mutantes blancos son de color blanco y por lo tanto a veces se puede confundir con el intestino. Mayoría de las cepas transgénicas, que son típicamente en un fondo blanco, también tienen testículos blancos porque el gen de mini-blanco que se encuentra en P-elementos no promueve la acumulación de pigmen.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Michael Anderson para establecer en el laboratorio Lee estos métodos aceptados para el estudio de la espermatogénesis con asesoramiento de expertos de Karen Hales. H. Oda y Y. Akiyama-AOD ofrecida generosamente la γ-tubulina-GFP de stock volar. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 a LAL (GM074044).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Elastómero de silicona de dos partes para la fabricación de placas de disección recubiertas de silicona de la placa de Petri Kimax |
| Bolígrafo PAP | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Protector de uñas transparente | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Reactivo antidecoloración con DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Anticuerpo anti-gamma-tubulina de ratón (clon GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Tritón X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Etanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehído | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Úselo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para siliconar los cubreobjetos |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg / ml en etanol al 75%; almacenar a -20 & grados; C |
| NaCl | Productos de Investigación Internacional Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes limpiaparabrisas para tareas delicadas | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | de grado de biología molecular |
| , tapón de rosca | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 70315 | |
| Portaobjetos de microscopio esmerilados simples | Corning | 2948-75X25 | |
| Portaobjetos de microscopio recubiertos de poli-L-lisina | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Opcional (para reemplazar los portaobjetos de microscopio sin tratar) |
| Cubierta de vidrio cuadrada | Corning | 2865-22 | |
| Hojas de afeitar | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Placa de Petri | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 |
| Pinzas | Dumont | 52100-51S | Patrón 5 |
| Estereoscopio INOX Stemi 2000-CS | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Objetivo Nikon | ||
| Plan-Fluor 40X | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40X objetivo | Carl Zeiss |
Referencias
- McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Bonacc....
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Reimpresiones y permisos
