El circuito de alimentación en larvas de Drosophila melanogaster sirve un modelo simple pero potente que permite a los cambios en la tasa de alimentación que se correlacionan con las alteraciones en los circuitos neurales stomatogastric. Este circuito se compone de las neuronas serotoninérgicas centrales que envían proyecciones a los ganchos de la boca así como el intestino anterior.
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Artículo de método
Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila
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Resumen
Resumen
El circuito de alimentación serotonérgica en larvas de Drosophila melanogaster se puede utilizar para investigar los sustratos neuronales de importancia crítica durante el desarrollo del circuito. Uso de la salida funcional del circuito, la alimentación, los cambios en la arquitectura neuronal del sistema stomatogastric puede ser visualizado. El comportamiento de alimentación se puede grabar mediante la observación de la tasa de retracción de los ganchos de la boca, que reciben inervación desde el cerebro. El comportamiento locomotor se utiliza como un control fisiológico de la alimentación, ya que las larvas utilizar sus ganchos de la boca para atravesar a través de un sustrato de agar. Los cambios en el comportamiento de alimentación se pueden correlacionar con la arquitectura axonal de las neuritas que inervan el intestino. El uso de inmunohistoquímica es posible visualizar y cuantificar estos cambios. Un manejo inadecuado de las larvas durante los paradigmas de comportamiento puede alterar los datos, ya que son muy sensibles a las manipulaciones. Imagen adecuada de la arquitectura de axones inervanel intestino es crítico para la cuantificación precisa de número y tamaño de las varices, así como el grado de los nodos de ramificación. El análisis de la mayoría de los circuitos permite sólo para la visualización de la arquitectura de axones o efectos en el comportamiento, sin embargo, este modelo permite correlacionar la salida funcional del circuito con las deficiencias en la arquitectura neuronal.
Introducción
Drosophila es un sistema de modelo muy potente para estudiar el desarrollo de circuitos neuronales debido a un rápido tiempo de generación, coste experimental bajo, y la capacidad para manipular y controlar los factores genéticos y ambientales. La neurogénesis, hallazgo camino neuronal y la sinaptogénesis se conservan entre los humanos y Drosophila, por lo que los mecanismos de la creación, mantenimiento y modificación de los circuitos neuronales se conservan también.
Neurotransmisores clásicos, como la serotonina (5-hidroxitriptamina o 5-HT) pueden servir como factores de crecimiento, antes de adoptar su papel como moléculas de señalización en el circuito neural madura 1-3 Estudios anteriores han demostrado que perturbado niveles de 5-HT durante la embriogénesis alterar la conectividad de las neuronas maduras 4. Otros han demostrado que la aplicación ectópica de 5-HT a las neuronas cultivadas Helisoma reprimir el crecimiento de neuritas, así como la sinaptogénesis 5-7. En Drosophila, de desarrollo los niveles de 5-HT están inversamente relacionada con el número de varicosidades y tamaño, así como el grado de aborization, a lo largo de la longitud de las neuritas que se proyectan hacia el intestino anterior del SNC 8.
La neurotransmisión serotonérgica se ha demostrado que modulan los comportamientos de alimentación en diversas especies, incluyendo Drosophila 8-9. El circuito de alimentación en Drosophila es un circuito relativamente simple que se puede utilizar como un modelo para correlacionar la salida funcional (alimentación) con alteraciones en el desarrollo de las proyecciones axonales desde el cerebro hasta el intestino anterior. Schoofs et al. han demostrado que la alimentación de las larvas de Drosophila está regulado por generadores de patrones centrales que influyen en la musculatura 10. Mientras que la anatomía muscular específico no se comprende completamente, se ha demostrado que el nervio antenal, nervio maxilar, y el nervio accesorio protorácica son responsables de los objetivos musculares implicados en lael comportamiento de alimentación. La mayoría de los datos relacionados con la musculatura y nervios Anatomía de la alimentación de invertebrados se limita a las larvas Calliphora.
La tasa de alimentación de larvas de segundo instar se puede evaluar por la retracción de las Escleritos cefalofaríngeos (ganchos de la boca), y es reproducible y de alto rendimiento. Las placas cefalofaríngeos están inervadas por fibras de las neuronas centrales 5-HT a través del nervio frontal. El proventrículo o intestino anterior, está inervado por fibras serotoninérgicos (Recurrens nervio) que fasciculada en el intestino medio y son responsables de las contracciones del intestino anterior (Figura 1) 11-12. Los cambios en la ramificación axonal, y el número y tamaño de las varices a lo largo de la longitud de las neuritas, se pueden cuantificar utilizando técnicas inmunohistoquímicas. Manipulación de 5-HT neuronal durante el desarrollo, ya sea directamente o indirectamente, puede cambiar la salida funcional de este circuito de alimentación, que puede ser evaluado y se correlacionó con los cambios en la morfologíasGy de la arquitectura de las neuritas.
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Protocolo
1. Mantenimiento de las jaulas de población
- Mantener las jaulas de población a 25 ° C en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Mientras los grupos de control y experimentales se exponen a las mismas condiciones de iluminación, entonces esta técnica se puede realizar en un entorno de laboratorio estándar.
- Permitir que las hembras pongan huevos durante la noche en placas de agar-jugo de manzana.
- Recoger las larvas recién eclosionadas, manteniendo las placas con los huevos recién depositados a 25 ° C durante 24 horas. Coloque una pequeña cucharada de levadura en el centro del plato para atraer larvas eclosionadas.
- Recoge 1 º estadio las larvas que han migrado a la pasta de levadura en el centro de la placa de jugo de manzana. Use una espátula de metal para transferirlo a una placa de jugo de manzana fresca. Pasta de levadura adicional puede ser añadido para asegurar que haya una alimentación adecuada hasta que se realizan los ensayos. Placas de zumo de uva también se pueden utilizar en lugar de placas de jugo de manzana.
- Obtener la tarde 2-nd temprana 3 º estadio larvae al permitir que el 1 de instares a la edad de 40 a 48 h. Dentro de este rango las tasas de alimentación son constantes 13. La edad puede ser confirmado por examen de los ganchos de la boca, ya que hay distintos cambios en esta estructura con cada muda larval.
- Tarde 2 3 º estadio las larvas-nd principios se recogen para los ensayos de comportamiento suavemente y extensamente usan platos de jugo de manzana con agua y la recolección de las larvas en un filtro de malla. Las larvas se transfieren después a una placa de agar.
- Todos los análisis se realizan en paralelo usando animales control y experimentales.
2. Paradigma de comportamiento - Locomoción
- Coloque un solo 3 º estadio larva en un sustrato de agar al 2% en un 100 mm placa de cultivo de tejidos y permitir que la larva se aclimate durante 30 segundos. Las larvas utilizar sus Escleritos cefalofaríngeos (ganchos de la boca) para impulsar sus cuerpos a través de la superficie del sustrato de agar. Esto se hace en un plato aparte porque it es más difícil de visualizar las contracciones del cuerpo en la solución de levadura como el animal es casi el mismo color que la levadura.
- Observar y registrar cada uno posterior para el movimiento anterior sobre el sustrato durante un periodo de 1 min. n = 20 para cada genotipo. No más de 10 animales deben ser analizadas por placa.
3. Paradigma de comportamiento - Alimentación
- Usando romos Inox # 5 pinzas, transferir cuidadosamente la larva de estadio 3 ª de la placa de agar locomotora al centro de una placa de agar-llenado superpuesta con 5 ml de solución de levadura 2% de panadero activado. Asegúrese de que la solución es homogénea como la levadura se asentará en el tiempo. Cuando en la solución de levadura, las larvas en gran medida se mantendrá en su lugar y alimentación, facilitando la observación de la conducta. La tasa de las contracciones de gancho de la boca se correlaciona directamente con la cantidad de comida ingerida 14.
- Permita que la larva se aclimate durante 30 segundos.
- Observar y registrar el número decontracciones de gancho en la boca durante un periodo de 1 min. n = 20 para cada genotipo.
4. Las disecciones intestino de la larva
- Prepare una solución de fijación de formaldehído EM-grado 4% en 1x tampón fosfato-salino (PBS) y se pone en un vaso punto 3 pocillos.
- Diseccionar cuidadosamente deambulando tarde 3 º estadio larval agallas en un plato de cristal 3-bien utilizando la solución PBS 1x, asegurándose de que cada vez que el proventrículo se deja intacta. Con una pinza, mantenga el extremo posterior, y con la otra, sostenga los ganchos de la boca. Mientras sujeta el extremo posterior inmóvil, tire suavemente de los ganchos de la boca para poder acceder a las tripas. Retire todos los tejidos asociados (glándulas salivales, el cerebro, la grasa corporal, etc), a continuación, transferir cada tripa al plato 3 pocillos que contiene la solución de formaldehído. Vagando 3 º estadio larva se utilizan porque en esta etapa del desarrollo, la larva deja de alimentarse en la preparación para pupariation y proventrículo se borra de la levadura.
- Incubar las tripas a 4 ° C durante la noche en una caja de cultivo de tejidos opaca.
- Antes de retirar la solución de fijación de formaldehído de los pozos, retire el ciegos gástricos y clip del intestino medio ~ 150 m 2 del proventrículo de manera que las proyecciones se pueden ver claramente y sin impedimento.
- Retire solución de formaldehído de los pocillos y reemplazar con 1x PBT (1x PBS, 0,1% de albúmina de suero bovino libre de proteasa, X-100 0,1% de Triton) solución tampón. Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Coloque las muestras de tejido sobre un agitador rotatorio mientras se hace lavados.
- Se incuba a 4 ° C durante 1 hora en 10 -6 M 5-HT para mejorar la señalización de la serotonina. Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Estudios anteriores han demostrado que esta concentración de exógena 5-HT no afecta a la arquitectura neuronal o la densidad de várices en los análisis inmunohistoquímicos y simplemente mejora la relación señal a ruido 15-16.
- Incubar a 4 y# 176; C durante la noche en el anticuerpo primario anti-serotonina (monoclonal de ratón o policlonal de conejo). Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Coloque las muestras de tejido sobre un agitador rotatorio mientras se hace lavados.
- Incubar a 4 º C durante 90 min en anticuerpo secundario (Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón o anti-IgG de conejo; 1:400 dilución). Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Coloque las muestras de tejido sobre un agitador rotatorio mientras se hace lavados.
- Incubar en carbonato de sodio 4 mM durante 10 minutos sobre un agitador rotatorio, a continuación, montar en 4% de carbonato de sodio mM gallate/20 n-propilo, y vista en virtud de la fluorescencia. El carbonato de sodio se utiliza para convertir las muestras en la memoria intermedia y el pH utilizado en los medios de comunicación medio de montaje.
- Captura imágenes de muestras de tejidos immunostained con un aumento de 400X para el análisis.
5. Análisis de circuitos neuronales
- Fibras neuritas se cuantificaron (número y tamaño de las varicesy el grado de ramificación) usando Neuroleucida y Neuroexplorer. Sin embargo, esto también puede realizarse de forma manual o mediante simple Neurite trazador (una aplicación gratuita que se puede descargar en línea).
- Trazar las proyecciones de fibras individuales desde el cerebro hasta el proventrículo y cuantificar el número de várices, las ramas y el número de las várices grandes por unidad de longitud. Las fibras axonales que se proyectan desde el cerebro se encuentran agrupados en el nervio Recurrens y no son accesibles para el análisis hasta que alcanzan el proventrículo donde se separan y fasciculada.
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Resultados
El circuito de alimentación serotoninérgicos en la larva de Drosophila puede servir como un modelo muy eficaz para observar la influencia de determinados factores en el desarrollo del sistema nervioso. Por la cuantificación de la tasa de alimentación, es posible vincular la arquitectura axonal del circuito de alimentación con su salida funcional (Figura 1). El ensayo del aparato locomotor se utiliza como un control fisiológico de las retracciones de los ganchos de la boca, ya que las larvas uti...
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Discusión
Desarrollo aberrante del circuito stomatogastric serotoninérgico, que ocurre durante la embriogénesis tardía, afectará a su función maduro. Los cambios en la arquitectura de neuritas que inervan el intestino puede ser correlacionada con la salida funcional del circuito, que es la tasa de alimentación (medido por contracciones de gancho de la boca en una solución de levadura) (Figura 1). El uso del sistema bipartito UAS-Gal4 en Drosophila hace que sea posible se dirigen específicamente hacia arr...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer Fondo de Investigación del Presidente de Saint Louis University adjudicado a WSN
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio Eclipse E-800 | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Se utiliza para analizar la arquitectura de la fibra intestinal, no es necesario tener |
| el software de imagen Northern Eclipse | Empix Inc | ||
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filtro para anticuerpo |
| secundario específicoN.A. 0,75; Diámetro exterior: 0,72 mm; Prisma DIC: 40xI, 40x I-C; | Instrumentos Nikon accionados | MRH00400 | Objetivo utilizado para la obtención de imágenes |
| Trazador de neuritas simple | Imagen NIH J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
