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Artículo de método

La ligadura y punción cecal inducida por sepsis como un modelo para estudiar la autofagia en ratones

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DOI:

10.3791/51066

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9 de febrero de 2014

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1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

En este artículo

Resumen

La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP) ligadura y punción cecal. Los protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis inducida por CLP se presentan aquí: Un protocolo para la medición de la autofagia utilizando ratones (GFP)-LC3, y de un protocolo para la medición de la formación de autofagosoma por microscopía electrónica.

Resumen

La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP), que causa la sepsis polimicrobiana ligadura y punción cecal. Aquí, se proporciona un protocolo para inducir la sepsis de diversa gravedad en ratones utilizando la técnica de CLP. La autofagia es una respuesta de los tejidos fundamentales para el estrés y la invasión de patógenos. Dos protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis experimental también se presentan aquí. (I) Los ratones transgénicos que expresan la proteína de fluorescencia verde proteína de fusión (GFP)-LC3 son sometidos a CLP. Mejora localizada de la señal de GFP (puntos lagrimales), tal como se ensayaron, ya sea por ensayos inmunohistoquímicos o confocal, se puede utilizar para detectar la formación de autofagosoma mejorada y, por lo tanto, la activación alterada de la vía de la autofagia. (II) mejorada vacuola de autofagia (autofagosoma) formación por unidad de área de tejido (como un marcador de la estimulación de la autofagia) puede cuantificarse utilizando microscopía electrónica. El estudio de las respuestas autofágicas a sepsis es un borrador críticoonent de la comprensión de los mecanismos por los que los tejidos respondan a la infección. Resultados de la investigación en esta área pueden contribuir en última instancia, hacia la comprensión de la patogénesis de la sepsis, lo que representa un problema importante en la medicina de cuidados críticos.

Introducción

La sepsis, una respuesta inflamatoria sistémica a la infección, representa la principal causa de muerte en los pacientes críticamente enfermos 1. Las infecciones intra-abdominales, a menudo conduce a la sepsis polimicrobiana, representan el 20% de los casos de sepsis, que tienen una mortalidad considerable de hasta un 60% 2. La mortalidad asociada a la sepsis se debe principalmente a la disfunción multiorgánica con insuficiencia orgánica posterior 3,4. Investigación adicional en el mecanismo patogénico de esta enfermedad es una necesidad urgente de promover el desarrollo de terapias novedosas y más eficaces.

El método de ligadura cecal y punción (CLP) es un procedimiento comúnmente utilizado para el modelado de la sepsis en vivo. Como el ciego está llena de bacterias, sus resultados de punción en la peritonitis polimicrobianas, la translocación de bacterias en la sangre (bacteriemia), shock séptico, disfunción de múltiples órganos y, en última instancia, la muerte 5. Se acepta en general que refleja CLP clínicarealidad con mayor precisión que las técnicas anteriores, tales como la inyección de endotoxina o bacterias incluso purificados en roedores, Por lo tanto, CLP se considera el estándar de oro (aunque no sin limitaciones) 6 para la inducción experimental y, por lo tanto, la investigación de la patogénesis de la sepsis. En esta monografía, se describen los protocolos diseñados para evaluar si los mecanismos patogénicos de la sepsis incluyen la autofagia.

La autofagia, un proceso celular conservado evolutivamente, facilita la facturación de proteínas y orgánulos tales como mitocondrias dañadas y juega un papel importante en el aclaramiento de los patógenos intracelulares, incluyendo bacterias 7,8. Durante la autofagia, proteínas u orgánulos citosólicas son secuestradas en vesículas unidas a la membrana dobles llamados autofagosomas, que posteriormente se entregan a los lisosomas para degradación 9. Un número de proteínas se han identificado como los homólogos de mamíferos de genes relacionados con la autofagia (ATG),originalmente identificado en la levadura, que regulan el proceso de autofagia. La conversión de la proteína asociada a microtúbulos-1 de la cadena ligera 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) de-I LC3B (forma libre) a LC3B-II (forma-fosfatidiletanolamina conjugado) representa un paso importante en la formación autofagosoma 9. Disfunción autofagia se asocia con el envejecimiento y enfermedades humanas incluyendo cáncer y trastornos neurodegenerativos 10. Por otra parte, la autofagia afecta la inmunidad innata y adaptativa, tales como la presentación de antígenos, el desarrollo de linfocitos y la secreción de citoquinas por las células inmunes 8. Por lo tanto, parece razonable que la autofagia también podría desempeñar un papel en la respuesta inflamatoria sistémica a la infección (es decir, en la sepsis).

Hasta la fecha se han descrito varios métodos para evaluar el papel de la autofagia en la lesión tisular in vivo. Estos incluyen el uso de ratones que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP)-LC3 y la cuantificación de Autofagosomas en el tejido por microscopía electrónica (estos dos métodos se describen en esta monografía). Métodos adicionales incluyen la cuantificación de la expresión de la proteína de la autofagia en homogeneizados de tejido, y el análisis de flujo de autofagia (como se describe en otra parte) 11-13. El objetivo de esta revisión es proporcionar los protocolos actuales para la evaluación de la autofagia en vivo en el contexto de la sepsis experimental.

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Protocolo

Nota: El Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso en el Brigham and Area Escuela de Medicina Hospital / Harvard de la Mujer aprobó los siguientes procedimientos.

1. La ligadura y punción cecal

Utilice ratones del mismo fondo (C57BL / 6), macho, de 8-10 semanas de edad. Los ratones hembra que son más resistentes que los hombres contra la letalidad inducida por la sepsis. Los ratones de más edad de 8 semanas producen menos resultados variables que los ratones más jóvenes en términos de supervivencia después de CLP. Aproximadamente N = 10 ratones por grupo en comparación deben ser utilizados para el análisis de supervivencia. N = 3-5 ratones es adecuada para los ensayos de la autofagia.

  1. Use pequeños instrumentos quirúrgicos estériles (es decir, de bisturí, tijeras y pinzas anatómicas contundentes), que deben ser apropiados para la cirugía de roedores.
  2. Preparar la mezcla de anestesia: Para 7,95 ml de PBS añadir 150 l de xilazina (anased inyección de 100 mg / ml) y 700 l de Ketamina (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
  3. Para garantizar condiciones asépticas durante el procedimiento, usar guantes, mascarilla y bata quirúrgica.
  4. Pesar animales. Anestesie ellos mediante la inyección intraperitoneal (IP) de la mezcla mencionada en el paso 3 en una dosis de l (10 veces el peso corporal en g). Por ejemplo, para un ratón de pesaje 22 g, administrar 10x22 = 220 l de la mezcla anestésica. Por lo tanto, las dosis finales de xilazina y ketamina son 17 y 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Asegúrese de que la anestesia es adecuada; sin flexión de las extremidades se debe producir después pizca dedo del pie Nota:. Use pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  5. Coloca los animales sobre una superficie de trabajo limpia en sus espaldas. Las colas y las patas traseras se orientan hacia el investigador. Desinfectar la piel del abdomen usando alcohol (solución EtOH 70%) Nota:. Área quirúrgica debe estar completamente afeitado, para evitar la contaminación de la herida a través del contacto conpiel. También, de manera óptima, un cojín de agua caliente circulante se debe utilizar para mantener la normotermia de los ratones anestesiados durante la cirugía.
  6. Mediante el uso de un bisturí, hacer una pequeña incisión en la piel longitudinales paralelos y aproximadamente 1 cm de izquierda a la línea media. No penetrar todavía en la cavidad peritoneal. Utilice pequeñas tijeras para prolongar la incisión inicial.
  7. Identificar los músculos abdominales y diseccionar para obtener acceso a la cavidad peritoneal.
  8. Mediante el uso de fórceps anatómicas romos, identificar el ciego y moverlo fuera de la cavidad peritoneal. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos mesentéricos (esto podría dar lugar a una hemorragia letal).
  9. Ligar 60% del ciego para lograr una sepsis de grado medio. La ligadura igual o más de 75% del ciego generalmente resulta en la sepsis de alto grado, mientras que la ligadura de igual o menos de 25% de los resultados de ciego en la sepsis de bajo grado. Tenga cuidado de no ligar la válvula ileocecal (esto podría bloquear la continuidad intestinal).
  10. Mediante el uso de un21 G aguja, perfore el intestino ciego por una punción a través de-y-medio (dos agujeros), cerca de la ligadura. La dirección de la perforación debe ser de la mesentérica hacia el lado anti-mesentérica del ciego. Tenga cuidado de no perforar los vasos sanguíneos mesentéricos.
  11. Retire la aguja. Exprimir suavemente el ciego se ligó para confirmar la permeabilidad a través de los dos agujeros; sólo una pequeña cantidad de heces debe ser extruida a través de ellos.
  12. Mueva el ciego ligado y perforado en la cavidad peritoneal.
    Nota: Para los ratones sham, omita los pasos 01.10 a 01.12.
  13. Utilice suturas quirúrgicas de seda 6-0 con el corte de la aguja para cerrar la musculatura abdominal. Utilice suturas quirúrgicas de seda 6-0 con el corte de la aguja para cerrar la piel abdominal.
  14. Inyectar 1 ml precalentado (37 ° C) IP salina normal para reemplazar el calor y la hidratación perdida durante el procedimiento. Coloque los ratones bajo una lámpara de calor hasta que su reanimación Nota:. De manera óptima, un dispositivo de calentamiento más seguro (SUCH como una almohadilla de agua caliente circulante) se puede utilizar en lugar de una lámpara de calor.
  15. Después de la operación inyectar buprenorfina (0,05 mg / kg sc peso corporal.) Para lograr una analgesia Nota:. Un animal no debe ser dejado sin atención hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Un animal que ha sido sometido a un tratamiento quirúrgico no debe ser devuelto a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
  16. Coloque de nuevo los animales en sus jaulas con acceso ilimitado a comida y agua. Los ratones se sacrificaron cuando se convierten moribunda (indicado por los signos clínicos tales como la insuficiencia de moverse cuando se les toca o cianosis). Compruebe ratones cada 4 horas para evitar tener que mueran antes de la eutanasia.

2. Tissue Harvest y Fijación

  1. Preparar una solución al 4% de paraformaldehído (PFA): Para 889 ml de PBS añadir 111 ml de 37% PFA.
  2. Sacrificio ratones utilizando CO narcosis 2 inducida-o ketamina / xilazina slución en una dosis alta.
  3. Inmovilizar el ratón sobre una superficie de trabajo limpia. Rociar la piel abdominal y torácica con una solución de EtOH 70% para desinfectarla.
  4. Utilice un escalpelo y tijeras pequeñas para eliminar la piel abdominal y torácica, así como la piel que cubre la zona traqueal.
  5. Revelar la tráquea mediante la eliminación de sus tejidos circundantes (músculos y tejido conectivo).
  6. Coloque una sutura (sin cortar la aguja) alrededor de la tráquea. No apriete todavía.
  7. Use un pequeño catéter venoso periférico (20 G) a la tráquea 'intubate'. Tenga cuidado durante la inserción del catéter para evitar la rotura traqueal. Tenga en cuenta que el mayor diámetro de la tráquea es justo por debajo del cartílago cricoides.
  8. Apriete la sutura alrededor de la tráquea / catéter. Retire la aguja dejando sólo la cánula de plástico del catéter en la tráquea. Aguja sirvió sólo como una guía-hilos para la inserción de la cánula de plástico.
  9. Después de haber obtenido la cánula de plástico dentro de la tráquea, corte the musculatura abdominal, abrir el abdomen y revelar el diafragma.
  10. Usando una aguja, perforar el diafragma para producir neumotórax (es decir, inserción de aire en la cavidad pleural). Los pulmones deben entonces se derrumbaron.
  11. Utilizando unas tijeras pequeñas, retire el diafragma, corte a lo largo del esternón (esternotomía), retire la caja torácica y revelar el corazón y los pulmones.
  12. A través de la cánula de plástico insertado en la tráquea, fijar los pulmones con la solución de formaldehído en 30 cm H 2 O de presión.
  13. Retire los pulmones y colocarlos en el 4% PFA durante 24 horas y, posteriormente, en el 70% de solución de EtOH hasta su procesamiento.
  14. Identificar y eliminar el corazón, el hígado y los riñones. De la misma manera, los situará en el 4% de PFA durante 24 horas y, posteriormente, en 70% de solución de EtOH hasta su procesamiento.

3. Los ratones GFP y la visualización de las buenas prácticas agrarias Diapositivas

  1. Realice CLP y cirugía simulada en ratones GFP-LC3 como se describe en el paso 1, y el procedimiento postoperatorios como se describe en el paso 2 del protocolo.
  2. Incrustar los tejidos (es decir, los pulmones, el corazón, el hígado y los riñones) en parafina y cortadas en serie 5 micras secciones.
  3. Cuando esté listo para la tinción de GFP, se incuba a 60 ° C durante 30-60 minutos hasta que se derrita de parafina y el tejido fino aparece translúcida.
  4. Desparafinar con la serie estándar graduada de xileno o xileno sustitutos, 5 min xileno 1, 2, xileno y xileno 3 entonces 3 incubaciones min en serie graduada de EtOH: 100%, 95%, 75%, y luego enjuague con agua destilada.
    Nota: Después de deparaffinization evitar la deshidratación del tejido, lo que aumenta el fondo de la muestra.
  5. Realizar la recuperación de antígenos usando tampón de ácido cítrico (10 mM de ácido citrato de sodio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), en el microondas durante 10-20 min. Tenga cuidado para reemplazar periódicamente tampón para evitar la desecación de los tejidos.
  6. Dejar enfriar durante 20 minutos en el banquillo para completar la recuperación de antígenos.
  7. Lave 2-3x con PBS. Retire el exceso de buffer y transfer desliza de bastidor a la posición horizontal en una caja de diapositivas u otra cámara húmeda para evitar la desecación.
  8. Bloquear 45-60 min a temperatura ambiente con 10% de suero normal de burro (también 5% de albúmina de suero bovino, o preferiblemente suero del animal en el que se generó el anticuerpo secundario) en PBS.
  9. Incubar las muestras en anticuerpo GFP primario a una dilución 1:100 en PBS durante la noche en 4 º C en cámara húmeda. Aplique suavemente pequeñas piezas de Parafilm sobre el tejido con un anticuerpo para promover el contacto homogéneo con el tejido y evitar la evaporación.
    Nota: los pasos restantes se realizaron a temperatura ambiente.
  10. Lavar 5 veces con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo primario. Incubar con anticuerpo secundario 1:500-1:1,000 en PBS durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
  11. Lavar 5 veces con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo secundario. Si se desea, contrateñir las diapositivas en este paso.
  12. Si se utiliza un anticuerpo secundario fluorescente, incubar 0,1% Sudán Negro en el 70% de EtOH fo 15-20 minutos para reducir la autofluorescencia. Limpie el exceso de Sudán Negro de todo el tejido y lavar 5 veces con PBS durante 20 min.
  13. Montar muestra con cubreobjetos y almacenar en posición horizontal, hasta que la solución de montaje se ha puesto.

4. Protocolo Alternativo: Detección directa de GFP-LC3

  1. Cannulate y inflar los pulmones con un ~ 500 ml de 50/50 v / v octubre PBS.
  2. Incrustar en octubre, poniendo una pequeña cantidad de octubre en el fondo de un criomolde.
  3. Coloque con cuidado el complejo de pulmón diseccionado en el molde.
  4. Lentamente congelarse metilbutano refrigerados utilizando hielo seco.
  5. Añadir más octubre hasta que el tejido está completamente cubierta y sólido congelado. Mantener en hielo seco y se almacenan a -80 ° C.
  6. El uso de un criomicrotomo, corte 5-10 micras de espesor secciones que protegen las secciones de la luz. Secciones de las tiendas y el tejido restante a -80 ° C.
  7. Para preparar diapositivas para imágenes, quitar la sección del congelador y aplicar inmediatamente una gota de PBS para evitar la desecación.
  8. Fijar durante 30 minutos con 4% PFA. Lavar con PBS.
  9. Aplicar DAPI / Hoescht durante 10 min. Lavar 3 veces con PBS.
  10. Montar muestra con cubreobjetos y almacenar en posición horizontal, hasta que la solución de montaje se ha puesto.
  11. Imagen usando epifluorescencia o un microscopio confocal. Muestras a 4 ° C hasta por un mes.

5. Preparación de tejidos para Microscopía Electrónica

  1. Cortar los tejidos en aproximadamente 1 mm para la fijación de los cubos.
  2. Fijar el tejido en 2% de formaldehído, 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M de tampón de cacodilato de sodio, pH 7,4.
  3. Lavar con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante 1-2 horas.
    Nota: tejido fijado se puede almacenar en cacodilato sódico 0,1 M a 4 ° C.
  4. Publicación de solución en 1% de tetróxido de osmio en 0,2 M tampón de cacodilato de sodio durante 1 hora.
  5. Enjuagar en tampón de cacodilato de sodio 0,2 M durante 10 minutos 3 veces.
  6. Deshidratar en EtOH al 70%, 20 min 2x. Deshidratar en 90% de EtOH, 10 min 2x. Deshidratar en EtOH al 100%,20 min 2x.
  7. Incubar con óxido de propileno (propano epoxi) durante 10 min 2x.
  8. Incubar con la mezcla de resina de óxido de propileno / epoxi (50:50) durante 1 hora. La mezcla de resina epoxi es: 24 g Agar 100 de resina, 13 g de anhídrido dodecenilsuccınico, 13 g de anhídrido metilnádico y 1 ml de N-bencildimetilamina. Mezclar bien en un vaso de precipitados desechable usando una espátula de madera.
  9. Incubar durante la noche con resina epoxi en viales destapados (esto permite que cualquier óxido de propileno restante se evapore).
  10. Incrustar en cápsulas marcados con resina recién preparada. Polimerizar a 60 º C durante 48 h.
  11. Secciones de tejido fotografía utilizando un microscopio electrónico de transmisión a 80 o 60 kV en una placa de microscopio de electrones. Imprima las imágenes en papel fotográfico o almacenar los medios de comunicación como digitales.
  12. Analizar formación autofagosoma en células intactas que contienen núcleo. Campos de baja potencia (e. G. 2.000-4.000 X) se pueden utilizar para identificar las células nucleadas. Típicamente 6,800-10,000 X imágenes se utilizan para thes la cuantificación autofagosoma. Cuente autofagosomas por unidad de superficie 15-30 campos para representación estadística apropiada. Autofagosomas tienen estructura de doble membrana, donde autophogosomes etapa tardía se parecían vacuolas rellenas.

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Resultados

La bacteriemia está presente en los ratones a las 6 horas después de la sepsis inducida por el CLP 14. Los signos clínicos de sepsis (incluyendo escalofríos, taquipnea y la actividad motora) aparecen aproximadamente 12 horas después del procedimiento. Los ratones sometidos a CLP comienzan a morir en alrededor de 18 horas después de la inducción de peritonitis. Cuanto más grave es la sepsis tanto más aumenta la letalidad es 15. En detalle, la sepsis de alto grado provoca una mortalidad del 100% en u...

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Discusión

La principal ventaja de CLP es que permite a los investigadores estudiar la sepsis de diferentes niveles de gravedad (es decir, de bajo a medio y de alto grado). Gravedad de la sepsis inducida se ve afectada por la longitud del intestino ciego ligado (que el determinante más importante), el tamaño de la aguja utilizada para la punción y el número de agujeros realizados 15. Además, la cepa de ratón y el género pueden influir en la gravedad de la sepsis; varias cepas son más susceptibles que otros, y l...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia para declarar

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones HL108801 P01, R01-HL60234, HL55330-R01, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter recibió apoyo salarial del Lovelace Respiratory Research Institute.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
GFP-LC3 Ratones transgénicosRiken (Japón)RBRC00806GFP-LC3#53
XilacinaHenry-Schein568-0606Xilacina HCl Inyección Vet
KetaminaHenry-Schein995-2949Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOHFisherA405-20Grado histológico
EtOHFisherA407-1para esterilización
suturas quirúrgicas de seda 6-0Owens & Menor2300-0078OG, 017624
buprenorfina-HClHenry-Schein614-5157Buprenex Ampules
solución de paraformaldehído (37%)JTBaker S898-09
xilenosFisherX3P-1GAL
anticuerpo monoclonal anti-GFPLife TechnologiesG10362
HoeschtSigma944403
DAPIInvitrogenD1306
OCTVWR scientific25608-930
Sudán NegroSanta Cruzsc-203760
Grado EM Glutaraldehído 2,5% en cacodilato de sodioMicroscopía electrónica Ciencias15960
óxido de propilenoSigma240397
Agar 100 resinaAgar científico R1045
anhídrido dodecenilsuccínicoSigma46346
anhídrido metilnádicoSigma45359
N-bencildimetilaminaSigma185582

Referencias

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