Un método para Sistemática Electroquímica y electrofisiológico Evaluación de Neuronales Grabación Electrodos

Resumen

Diferentes recubrimientos de electrodos afectan al rendimiento de grabación neural a través de cambios en las propiedades electroquímicas, químicas y mecánicas. Comparación de los electrodos in vitro es relativamente simple, sin embargo la comparación de la respuesta in vivo típicamente se complica por las variaciones en la distancia de los electrodos / neurona y entre animales. Este artículo proporciona un método robusto para comparar electrodos de grabación neural.

Resumen

Los nuevos materiales y diseños para implantes neuronales se prueban típicamente por separado, con una demostración de rendimiento, pero sin referencia a otras características del implante. Esto se opone a una selección racional de un implante en particular como óptima para una aplicación en particular y el desarrollo de nuevos materiales basados ​​en los parámetros más críticos de rendimiento. En este artículo se desarrolla un protocolo in vitro y en ensayos in vivo de electrodos de registro neuronales. Parámetros recomendados para la prueba electroquímica y electrofisiológico se documentan con los pasos clave y los posibles problemas discutidos. Este método elimina o reduce el impacto de muchos errores sistemáticos presentes in vivo paradigmas más simples en las pruebas, especialmente las variaciones en la distancia de los electrodos / neurona y entre los modelos animales. El resultado es una fuerte correlación entre el crítico in vitro e in vivo en las respuestas, tales como la impedancia y Sirelación gnal-ruido. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para probar otros materiales de los electrodos y diseños. Las técnicas in vitro se pueden ampliar a cualquier otro método no destructivo para determinar los indicadores de rendimiento más importantes. Los principios utilizados para el abordaje quirúrgico en la vía auditiva también pueden ser modificados para otras regiones neurales o tejido.

Introducción

Implantes neuronales se están utilizando cada vez más para la investigación, el control de prótesis y tratamiento de trastornos tales como la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, y ^1,2 pérdida sensorial. La medición y / o control tanto de la composición química y eléctrica del cerebro es la base para todos los implantes neuronales. Sin embargo, es importante para administrar un tratamiento sólo cuando el tejido neural está en el estado aberrante a reducir los efectos secundarios ^3. Por ejemplo, los estimuladores cerebrales profundos para el tratamiento de la epilepsia se deben aplicar únicamente un impulso eléctrico al cerebro durante una convulsión. Algunos efectos secundarios pueden ser distonía, pérdida de memoria, desorientación, alteración de la función cognitiva, las alucinaciones inducidas, la depresión o la lucha contra la depresión ^3,4. En muchos dispositivos, un sistema de bucle cerrado, por tanto, es necesario registrar la actividad eléctrica y para activar la estimulación cuando se detecta un estado anormal. Los electrodos de registro también se utilizan para controlar Prodispositivos STHETIC. Es crítico para registrar la actividad neuronal objetivo con la mayor proporción posible de señal a ruido para lograr la activación más precisa y control del dispositivo. Una gran relación señal a ruido es también muy deseable para aplicaciones de investigación, como los datos más fiables se pueden obtener, lo que resulta en un menor número de sujetos de prueba requeridos. Esto también permitirá una mayor comprensión de los mecanismos y las vías implicadas en la estimulación de los nervios y la grabación.

Después de un implante neural ha sido colocado en el cerebro, una respuesta inmune se activa ^5,6. El curso temporal de la respuesta se divide generalmente en las fases agudas y crónicas, cada uno formado por diferentes procesos biológicos ^7. La respuesta inmune puede tener efectos dramáticos sobre el rendimiento del implante, tales como el aislamiento de los electrodos de las neuronas diana por encapsulación en una cicatriz glial o degradación química de los materiales de implante ^8.Esto puede reducir la relación señal a ruido de un electrodo de registro y la potencia de salida de un electrodo de estimulación, y el plomo al electrodo insuficiencia ^9. Selección cuidadosa del diseño y los materiales de implante son necesarios para evitar el fracaso durante la vida útil del implante.

Muchos diferentes materiales y diseños de implantes se han desarrollado recientemente para mejorar la relación señal-ruido y la estabilidad de los implantes para la grabación neural. Materiales de los electrodos han incluido platino, iridio, tungsteno, óxido de iridio, óxido de tántalo, el grafeno, nanotubos de carbono, polímeros conductores dopados, y, más recientemente, los hidrogeles. Materiales de sustrato ensayadas también incluye silicio, óxido de silicio, nitruro de silicio, de seda, de teflón, poliimida, y silicona. Diversas modificaciones de electrodos también se han investigado, usando recubrimientos tales como laminina, neurotrofinas, o monocapas y tratamientos auto-ensambladas utilizando electroquímica, plasma y técnicas ópticas. Diseño de implantess podría ser 1 -, 2 - o 3-dimensional con los electrodos generalmente en la punta de una sonda aislante o a lo largo del borde de un vástago para penetrar en los electrodos o en una matriz de 2 dimensiones para implantes de superficie de la corteza. Independientemente del diseño del electrodo o material, la literatura anterior ha demostrado típicamente el rendimiento del nuevo implante sin referencia a otras construcciones de implante. Esto impide una evaluación sistemática de sus propiedades.

Este protocolo proporciona un método para comparar diferentes materiales de los electrodos a través de una gama de técnicas analíticas y electrofisiológicos. Se basa en un artículo recientemente publicado que comparó 4 dopado diferente la realización de recubrimientos de polímeros (de polipirrol (Ppy) y poli-3 ,4-etilenodioxitiofeno (PEDOT) dopado con sulfato (SO ₄₎ o para-tolueno-sulfonato (PTS)) y 4 diferentes espesores de recubrimiento ^10. En este artículo se encuentra un material, PEDOT-PTS con un tiempo de deposición de 45 segundos,tenido el recuento más alta de señal a ruido y espiga con el ruido de fondo más pequeño y que estos parámetros eran dependientes de la impedancia del electrodo. PEDOT-PTS también se muestra bioestabilidad aguda superior en comparación con los otros polímeros dopados realización y electrodos de iridio desnudas. El protocolo permite que los parámetros críticos controlando la relación de señal a ruido y la estabilidad que se determine y se utiliza para mejorar aún más el rendimiento de electrodos de registro neuronales.

Protocolo

El protocolo ha sido aprobado por la Universidad de La Trobe (09-28P) y Comités de ética animal RMIT University (1315).

1. Preparación del electrodo y Pruebas preliminares in vitro

1. Preparar soluciones de deposición de recubrimiento del electrodo, por ejemplo 10 mM de 3,4-etilenodioxitiofeno (EDOT) y 0,1 M de sodio-tolueno-sulfonato (Na ₂ pts) para formar poli-3 ,4-etilenodioxitiofeno-PTS (PEDOT-PTS).
2. Conecte el sistema de electrodos a un potenciostato.
3. Coloque con cuidado la matriz de electrodos en la solución de deposición y la abrazadera en su lugar.
4. Coloque un contador de electrodo de malla de platino y el electrodo de referencia de Ag / AgCl en la solución de deposición y conectar a un potenciostato.
5. Uso de los potenciostato, revestimientos de depósito sobre los electrodos deseados. Las condiciones de deposición (potencial, corriente y tiempo) pueden variar dependiendo de los recubrimientos deseados. Para revestimientos PEDOT-PTS, un pote aplicadontial de 1 V para 15, 30, 45, o 60 seg se ha utilizado. Cuatro electrodos en la matriz deben ser recubiertas con el recubrimiento en una configuración escalonada (Figura 1).
6. Retire la guía de electrodos de la solución de depósito y enjuague suavemente con agua desionizada.
7. Repita el procedimiento de recubrimiento con otros materiales si lo deseas.
8. Preparar la solución de pruebas in vitro (fosfato disódico 0,3 M (Na ₂ HPO ₄₎ en agua desionizada).
9. Conecte el sistema de electrodos a un potenciostato.
10. Coloque con cuidado la matriz de electrodos en la solución de la prueba y la abrazadera en su lugar.
11. Coloque un contador de electrodo de malla de platino y el electrodo de referencia de Ag / AgCl en la solución de prueba y conectar a un potenciostato.
12. Usando el potenciostato, realice secuencial espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) (potencial de compensación de 0 V, amplitud de 10 mV, rango de frecuencia 10-100.000 Hz) y voltametría cíclica (ciclo 1 º, rango potencial 00,8 a -0,8 V, velocidad de exploración de 100 mV / seg) en todos los electrodos. Electrodos no probados se mantienen a potencial de circuito abierto y un tiempo de silencio de 1 segundo se utiliza entre cada prueba. Todos los electrodos 32 están en contacto con la solución para la sesión de prueba completa de 1 hr.
13. Retire la guía de electrodos de la solución de prueba y enjuague suavemente con agua desionizada.
14. Realizar las demás análisis deseados tales como la microscopía óptica.
15. Sondas de la tienda en un recipiente protector seco para evitar daños y el deterioro de las superficies de los electrodos.

2. La implantación de electrodos

1. Pesar la rata.
2. Inyectar de uretano (20% w / v en agua destilada, 1,3 g / kg ip) para la anestesia no recuperación.
3. Asegurar inicio anestesia probando durante un reflejo de retirada pizca dedo del pie. Si la anestesia no es suficiente, dosis suplementarias de uretano deben ser administradas (0,3 g / kg ip).
4. Aplicar lubricante ocular y, a continuación, afeitarse la cabeza de la unaIMAL.
5. Colocar el animal en decúbito prono sobre una placa homeotérmico e inserte una sonda rectal (37,5 ° C).
6. Coloque una barra de la oreja en la posición final de aproximadamente esperada dentro del marco estereotáxico, y luego ajustar el animal para colocar la barra de oído en el conducto auditivo externo.
7. Alinear la segunda barra de oído en el conducto auditivo externo contralateral. Desplazar el animal en las barras de oído para alinearse con el titular de los dientes.
8. El uso de pinzas de rata de dientes, abrir la mandíbula del animal, enganchar los incisivos superiores sobre el soporte del diente y la abrazadera de la nariz en su lugar.
9. Crear una incisión en la piel de la cabeza, de aproximadamente 1 mm a la derecha de la línea media y de 10 mm rostral a 10 mm caudal de lambda.
10. Retraer la piel y el músculo lateralmente desde la incisión para exponer los huesos parietal y interparietal Uso de solución de peróxido de hidrógeno 20% y una almohadilla de gasa, fregar la superficie del hueso expuesto.
11. Perforar un agujero de aproximadamente3 mm ² en la médula interparietal tan cerca de lambda y la línea media de lo posible y quitar el tapón de hueso. El uso de una solución salina estéril, enjuague el agujero para quitar el polvo de huesos o fragmentos de lo que puede dañar el electrodo.
12. Con unas tijeras romas-romo, diseccionar por debajo de la piel del cuello y crear una cavidad. Envuelva un alambre de Ag / AgCl en algodón, saturarlo con solución salina y luego insertar el electrodo de referencia dentro de la cavidad.
13. Hacer una incisión en la duramadre en el plano sagital con la punta de una aguja.
14. Coloque la guía de electrodos al manipulador electrodo y ajustar su posición sobre la abertura con un ángulo de rostro-caudal 19 °. Inserte manualmente el electrodo de aproximadamente 2 mm en el cerebro hacia el colículo inferior.
15. Conecte el altavoz a la barra hueca oreja izquierda.
16. Asegúrese de que el amplificador está encendido. A continuación, compruebe la anestesia de los animales antes de sellar la cámara de grabación.

3.Los ensayos in vivo

1. Entregar blancas ráfagas de ruido, (ruido gaussiano distribuido, 1-44 kHz, el tiempo de 10 ms subida del otoño) y vigilar la actividad en cada electrodo. La velocidad máxima a la que estalla fuera entregado es una explosión cada 200 ms.
2. Usando el microdrive motorizado, introduzca lentamente el conjunto de electrodos hasta que la actividad acústica impulsado se registra en los 3 electrodos más distales de cada vástago (el número y la posición de la actividad de grabación de electrodos pueden variar con la colocación de los electrodos o el diseño del electrodo).
3. Lleve a cabo el protocolo de estimulación acústica utilizando 300 repeticiones de 50 ms de ruido blanco ráfagas (ruido gaussiano distribuido, 1-44 kHz, 10 ms tiempo de subida-bajada) con una tasa de repetición de 1 seg a 70 dB, y registrar la actividad de múltiples unidades en cada electrodo ( velocidad de muestreo de 24,4 kHz).
4. Inserte lentamente la matriz de electrodos que otros 200 μ m en el IC de posicionar cada electrodo aproximadamente en la misma posición que el electrodo más distal de the la posición inicial de la grabación.
5. Repetir la estimulación acústica y el protocolo de grabación neural.
6. Continuar la inserción de la matriz de electrodos en 200 μ m pasos y la realización de la estimulación acústica y protocolo de grabación neuronal hasta que todos los electrodos han registrado actividad acústicamente expulsados ​​de por lo menos 3 posiciones (típicamente 8-12 posiciones de los electrodos en total).
7. Retraer la matriz de electrodos en 200 μ m pasos y continuar realizando la estimulación acústica y protocolo de grabación neuronal hasta que se alcanza la posición inicial matriz de electrodos.
8. Retraer con cuidado el conjunto de electrodos de forma manual.
9. Inyectar una sobredosis de pentobarbital sódico (Lethobarb; 200 mg / kg ip) para sacrificar al animal.
10. Enjuague suavemente la matriz de electrodos con agua destilada. Luego almacenar sondas en un recipiente protector seco para evitar daños y el deterioro de las superficies de los electrodos.

4. Post-implantación en vitPruebas ro

1. Enjuague suavemente la matriz de electrodos con agua destilada para eliminar cualquier contaminación.
2. Conecte el sistema de electrodos a un potenciostato.
3. Coloque con cuidado la matriz de electrodos en la solución de la prueba y la abrazadera en su lugar.
4. Coloque un contraelectrodo de malla de platino y un electrodo de referencia de Ag / AgCl en la solución de prueba y conecte con el potenciostato.
5. Usando el potenciostato, realice secuencial espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) (potencial de compensación de 0 V, amplitud de 10 mV, rango de frecuencia 10-100.000 Hz) y voltametría cíclica (ciclo 1, el potencial entre 0,8 y -0,8 V, velocidad de exploración de 100 mV / s ) en todos los electrodos. Electrodos no probados se mantienen a potencial de circuito abierto y un tiempo de silencio de 1 segundo se utiliza entre cada prueba. Todos los electrodos 32 están en contacto con la solución para la sesión de prueba completa de 1 hr.
6. Retire la guía de electrodos de la solución de prueba y enjuague suavemente con agua desionizada.
7. Pencaje de la matriz de electrodos en una solución de limpieza enzimática durante 24 horas.
8. Retire la guía de electrodos de la solución y enjuagar con agua destilada.
9. Conecte el sistema de electrodos a un potenciostato.
10. Coloque con cuidado la matriz de electrodos en la solución de la prueba y la abrazadera en su lugar.
11. Coloque un contraelectrodo de malla de platino y un electrodo de referencia de Ag / AgCl en la solución de prueba y conecte con el potenciostato.
12. Usando el potenciostato, realice secuencial espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) (potencial de compensación de 0 V, amplitud de 10 mV, rango de frecuencia 10-100.000 Hz) y voltametría cíclica (ciclo 1, el potencial entre 0,8 y -0,8 V, velocidad de exploración de 100 mV / s ) en todos los electrodos. Electrodos no probados se mantienen a potencial de circuito abierto y un tiempo de silencio de 1 segundo se utiliza entre cada prueba. Todos los electrodos 32 están en contacto con la solución para la sesión de prueba completa de 1 hr.
13. Retire la guía de electrodos de la solución de prueba yenjuague suavemente con agua desionizada.
14. Sondas de la tienda en un recipiente protector seco para evitar daños y el deterioro de las superficies de los electrodos.

Resultados

Un conjunto de electrodos típico utilizado para este protocolo experimental se muestra en la Figura 1. Hay 32 electrodos de iridio en 4 mangos con 413 μ m ² área geométrica nominal y un 200 μ m de paso. Cada segundo electrodo en la matriz se ha recubierto con uno de los cuatro recubrimientos de electrodos diferentes, etiquetados 1-4. Los materiales de revestimiento han sido cuidadosamente seleccionados por sus propiedades químicas, mecánicas y electroquímicas. Como se ha men...

Discusión

Este protocolo proporciona un método para comparar los recubrimientos de electrodos neurales de registro dentro de un animal. El diseño del electrodo utilizado es ideal para la implantación en una rata colículo inferior (CI), con dimensiones de una escala similar. Variaciones de este electrodo como más espacio entre vástagos impedirían que todos los vástagos de estar en la rata IC al mismo tiempo, mientras que los mangos más largos y un paso mayor entre los electrodos aumentan el riesgo de que las puntas de vástago entr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Atenuador programable	TDT	PA5	Controla la amplitud de la señal acústica a través de las frecuencias
Controlador de altavoces electrostáticos	TDT	ED1	Acciona los altavoces electrostáticos (EC1)
Altavoz electrostático acoplado	TDT	EC1	Entrega sonido al animal
Estación base de procesamiento	TDT	RZ2	Registra la actividad neuronal de la matriz de electrodos (utilizando el preamplificador PZ2)
Preamplificador	TDT	PZ2-256	Preamplificador de alta impedancia de 256 canales
Procesador multifunción	TDT	RX6	Se utiliza para generar estímulos acústicos
Electrodo multicanal	Tecnologías	NeuroNexus A4 × 8– 5mm-200-200-413	Mazo de electrodos de 4 vástagos y 32 canales
Potenciostato	CH Instruments	CHI660B	Deposita recubrimientos de electrodos y realiza voltamperometría cíclica y EIS (utilizado con CHI684)
Multiplexor	CH Instruments	CHI684	Conmuta entre electrodos en el potenciostato
Fosfato disódico	Fluka	71644	Utilizado en la solución de prueba
3,4- Etilendioxitiofeno (EDOT)	Sigma Aldrich	483028	Un material de recubrimiento de electrodos
para-Sulfurato de tolueno (Na2pTS)	Sigma Aldrich	152536	Un material de recubrimiento de electrodos
Uretano	Sigma Aldrich	U2500	Utilizado para anestesiar al animal
Electrodo de plata/cloruro de plata	CH Instruments	CHI111	Se utiliza para probar el electrodo in vitro
Platinum	Electrode CH Instruments	MW4130	Se utiliza para probar el electrodo in vitro
Microdrive motorizado	Sutter Instruments	DR1000	Para controlar la posición de la guía de electrodos durante la cirugía
Limpiador enzimático	Medical Optics	Ultrazyme	Limpia la proteína de la guía de electrodos después de la implantación
Recinto acústico	TMC Ametek	83-501	Aísla al animal del ruido acústico y eléctrico
Marco estereotáxico	David Kopf Instruments	1430	Asegura y posiciona al animal
Controlador de temperatura	World Precision Instruments	ATC1000	Controla la temperatura del animal
Taladro óseo	KaVo Dental	K5Plus	Se utiliza para realizar la craniectomía
Aspirador	Flaem	Suction pro	Se utiliza para realizar la craniectomía