La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

Resumen

El wormsorter facilita pantallas genéticas en Caenorhabditis elegans clasificando gusanos de acuerdo a la expresión de los reporteros fluorescentes. Aquí se describe un nuevo uso: la clasificación de acuerdo a la colonización por un patógeno que expresa GFP, y lo empleamos para examinar el papel poco conocido de reconocimiento de patógenos en la iniciación de la respuesta inmune.

Resumen

El wormsorter es un instrumento similar a una máquina de FACS que se utiliza en los estudios de Caenorhabditis elegans, típicamente para ordenar gusanos basados ​​en la expresión de un indicador fluorescente. Aquí, destacamos un uso alternativo de este instrumento, para la clasificación de los gusanos de acuerdo a su grado de colonización por parte de un agente patógeno que expresa GFP. Este nuevo uso nos permitió abordar la relación entre la colonización del intestino del gusano y la inducción de la respuesta inmune. Mientras C. las respuestas inmunes frente a diferentes patógenos elegans se han documentado, todavía no se sabe lo que los inicia. Las dos posibilidades principales (que no son mutuamente excluyentes) son el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, y la detección de los daños causados ​​por la infección. Para diferenciar entre las dos posibilidades, la exposición al patógeno debe disociarse del daño que causa. El wormsorter permitido la separación de los gusanos que fueron colonizados extensamente por el Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, con el probable daño causado por la carga de patógenos, de los gusanos que fueron expuestos de manera similar, pero no es así, o marginalmente, colonizado. Se utilizaron estas poblaciones distintas para evaluar la relación entre la carga de patógenos y la inducción de respuestas inmunes de la transcripción. Los resultados sugieren que los dos se disocian, el apoyo a la posibilidad de reconocimiento de patógenos.

Introducción

Clasificación automática gusano es muy similar a FACS, operando mediante la medición de una señal fluorescente en un tornillo sin fin (normalmente proporcionado por la expresión transgénica de las proteínas informadoras) a medida que pasa enderezó en un tubo, lo que permite la redirección ya sea a un tubo de recogida / o bien a un contenedor de residuos de acuerdo para conmutar parámetros establecidos por el investigador ^1. El wormsorter puede facilitar la investigación de muchas maneras, un ejemplo de emplearlo como herramienta de análisis es un estudio que siguió los patrones espacio-temporales de la actividad promotora de casi 1.000 genes ^2. ....

Protocolo

1. La obtención de una Cultura Synchronized animales adultos jóvenes

1. Crecer gusanos en varias NGM placas sembradas con OP50-1 E. bacterias coli (10x concentrado de un cultivo saturado) hasta muchos gusanos alcanzaron la etapa grávido.
2. Tratar a los animales grávidos con solución huevo-prep para obtener un cultivo sincronizado (huevos).
3. Huevos Placa en varios de 60 mm NGM placas sembradas con 10x OP50-1 concentrado a una densidad de aproximadamente 150 a 200 huevos / placa.
4. Incubar las placas a 25 ° C durante 2 días (hasta que los gusanos han llegado a la L4 - etapa Adulto joven).

Resultados

Cuando se combina la edad, genéticamente idénticos C. elegans están expuestos a P. aeruginosa, una amplia distribución se observa en los niveles de colonización (Figura 1A). Con la ayuda del protocolo descrito aquí separación eficiente de no colonizada de gusanos colonizados se puede lograr (Figura 1B). A diferencia de los gusanos no colonizados, gusanos colonizados muestran signos de daño, tales como la lentitud y la reducción de la defecación al aire ^19. E.......

Discusión

El método que describimos aprovecha el etiquetado fluorescente de entidades fuera del gusano para seguir las interacciones entre el gusano y su entorno. En el caso que presentamos, la separación se basó en el etiquetado de un patógeno y se empleó para separar los gusanos con gran carga de patógenos de los que no tenían carga (o eran ligeros). El análisis posterior de la expresión génica no encontró diferencias en las respuestas inmunes entre los dos grupos, lo que sugiere que eran independientes de la carga de patógenos........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón M9	preparado en casa		Receta en wormbook.org
Rifampicina	Sigma	R3501
Solución de preparación de huevos	preparada en casa		50 ml de agua; 40 ml de lejía; 10 ml de placas de hidróxido de sodio de 10 N
	NGM preparadas en casa		Receta en wormbook.org
Placas SKP	preparadas en casa		Receta igual que NGM, solo 0.35% peptona en lugar de 0.25%Partículas de prueba de
control	Union Biometrica	310-5071-001