Artículo de método

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

DOI:

10.3791/51095

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22 de febrero de 2014

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1School of Life Sciences, University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, 3Research School of Biology, The Australian National University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe aquí un protocolo para la purificación y caracterización de complejos de proteínas vegetales. Demostramos que por immunoprecipitating una sola proteína dentro de un complejo, para que podamos identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y sus socios que interactúan.

Resumen

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Las plantas se adaptan rápidamente a los cambios del entorno, debido a la elaboración de la percepción y señalización. Durante el ataque de patógenos, las plantas responden rápidamente a la infección a través del reclutamiento y la activación de complejos inmunes. La activación de los complejos inmunes se asocia con modificaciones post-traduccionales (PTMs) de proteínas, tales como la fosforilación, glicosilación, ubiquitinación o. La comprensión de cómo son coreografiados estos PTM dará lugar a una mejor comprensión de cómo se logra la resistencia.

Aquí se describe un método para la purificación de proteínas con repeticiones ricas en leucina-nucleótidos vinculante (NB-LRR)-que interactúan las proteínas y la posterior identificación de sus modificaciones post-traduccionales (PTMs). Con pequeñas modificaciones, el protocolo se puede aplicar para la purificación de otros complejos de proteínas de la planta. El método se basa en la expresión de una versión epítopo de etiquetado de la proteína de interés, que posteriormente se purificó parcialmente By la inmunoprecipitación y se somete a espectrometría de masas para la identificación de proteínas que interactúan y PTM.

Este protocolo demuestra que: i). Los cambios dinámicos en PTM tales como la fosforilación pueden ser detectados por espectrometría de masas; ii). Es importante tener cantidades suficientes de la proteína de interés, y esto puede compensar la falta de pureza de la inmunoprecipitado; iii). Con el fin de detectar PTM de una proteína de interés, esta proteína tiene que ser inmunoprecipitada para obtener una cantidad suficiente de proteína.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vías inmunes se basan en diferentes modificaciones post-traduccionales (PTMs) de proteínas para transducir señales rápidamente y activar respuestas inmunes 1. Las PTM se alteraciones químicas rápidos, reversibles, y altamente específicos de la estructura de proteínas que pueden afectar a la conformación de proteínas, la actividad, la estabilidad, la localización, y las interacciones proteína-proteína 2-4. En las plantas, se han identificado más de 300 tipos de PTM incluyendo ubiquitinación, la sumoilación, sulfatación, glicosilación, fosforilación y 2,5. Un creciente cuerpo de evidencia pone de relieve la importancia de la PTM en diferentes aspectos de la inmunidad planta 1,5,6. La fosforilación de proteínas, la unión reversible de un grupo fosfato a una serina, treonina o tirosina es un regulador de muchas funciones celulares y no es sorprendente el más altamente estudió PTM en defensa de la planta cascadas de señalización 5-11. De señalización dependientes de la fosforilación es una parte integral de DEFE plantaactivación NSE inició después de la percepción extracelular de microbios por los receptores transmembrana, o el reconocimiento intracelular por proteínas de resistencia multidominio 5,8.

Tras la invasión de las plantas, los microbios son detectados por receptores de membrana de plasma llamados receptores de reconocimiento de patrones (RRP) 12. Parentales conocidos son o bien proteínas similares a receptor (RLP) o quinasas de tipo receptor (RLKs), tanto que lleva un ectodominio de unión a ligando y un dominio transmembrana de paso único. En contraste con los RLP, RLKs tienen un dominio de quinasa intracelular 13-15. El ectodominio de PRRS se une a moléculas con inductor microbio conservadas llamados patógenos-patrones moleculares asociados (PAMP) que conduce, en el caso de RLKs, a la autofosforilación y transfosforilación dentro del dominio intracelular 6, 16. Aguas abajo de la fosforilación inducida por la percepción de derechos y responsabilidades parentales, posterior fosforilación de las proteínas quinasas citoplasmáticas incluyendo 17, 18, E3 ligasas 19, activadas por mitógenos proteína quinasa (MAPK) 20, 21, dependientes de calcio proteínas quinasas (CDPK) 22, 23, y los factores de transcripción 24, 25 lleva a la inmunidad producida PAMP (PTI).

Además de la percepción extracelular por PRRS, el reconocimiento intracelular de patógenos se logra a través de receptores citoplasmáticos. Estos multidominio resistencia (R), las proteínas contienen un dominio variable N-terminal, una unión de nucleótidos-(NB) motivo central, y repeticiones ricas en leucina C-terminal (LRR) y por lo tanto denominan proteínas NB-LRR 26, 27. R proteínas directa o indirectamente reconocen moléculas de virulencia derivados de patógenos llamados efectores, también conocidos a los parentales y otros nodos del sistema inmune. Reconocimiento induce fuertes defensas que conducen a la inmunidad efectora activada por (ETI) 28-31. Proteínas NB-LRR tienen una requisiciónTE motivo de unión a ATP en el dominio NB 30, 32, pero carecen de un dominio de quinasa. La fosforilación de los dominios conservados de NB-LRR se ha informado en un estudio de proteómica a gran escala de 33, pero su relevancia para el IET no está claro. De manera similar a PTI, la activación de las proteínas NB-LRR conduce a la fosforilación de proteínas citoplásmicas incluyendo MAPKs 34-37 y 38-40 CDPKs. Lo más importante, el reconocimiento efector puede llevar a la fosforilación de proteínas accesorias que interactúan directamente con las proteínas NB-LRR 41. Algunos ejemplos incluyen RIN4 (Arabidopsis thaliana) y Pto. (tomate, Solanum lycopersicum) proteínas que interactúan con proteínas NB-LRR, RPM1 42, 43 y FRP 44, respectivamente. Durante la infección por bacterias Pseudomonas syringae, la proteína efectora AvrB induce RIN4 fosforilación, lo más probable por el receptor de la quinasa RIPK 45, 46. Del mismo modo, en la P. de tomate syringae efectores AvrPto y AvrPtoB inducen la fosforilación de Pto 47. En contraste con RIN4 que carece de un dominio quinasa y debe ser trans-fosforilado, PTO es una quinasa activa capaz de auto-fosforilación 48 y trans-fosforilación de los sustratos 49, 50. Mientras Pto requiere su actividad quinasa para la iniciación efector dependiente de la señalización, los mutantes Pto-quinasa muertos siguen siendo capaces de señalar de manera efector independiente 51. Le explicamos recientemente estas observaciones al demostrar que el complejo Prf / Pto es oligomérica, que contiene múltiples Prf y Pto moléculas de 52 y que las moléculas Pto dentro del mismo complejo se trans-fosforilar entre sí 47. Hemos propuesto un modelo en el que una molécula de Pto (sensor) interactúa con las proteínas efectoras, provocando un cambio en la conformación de la proteína NB-LRR (PRF), que a su vez activa una segunda molécula Pto (ayudante) ingeniohin complejo. Posteriormente, el ayudante Pto molécula de trans-fosforila el sensor Pto conduce a la activación completa de la resistencia compleja 47.

Estos ejemplos demuestran que la identificación de los componentes de complejos inmunes y sus posibles PTM a partir del reconocimiento de efectos puede conducir a una mejor comprensión de cómo las señales son transducidas de la percepción de efector a objetivos de abajo. Aquí se describe un método de purificación de proteínas por proteínas NB-LRR-que interactúan y la posterior identificación de sus PTM. Utilizamos Nicotiana benthamiana y el complejo de tomate Prf / Pto como modelo, pero el mismo protocolo se puede aplicar fácilmente a RLKs de N. benthamiana y A. 53 thaliana con pequeñas modificaciones como se describe en el protocolo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: todos los pasos se realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación de materiales vegetales y Buffers

  1. Por N. benthamiana
    1. Crece el Agrobacterium tumefaciens cepas de interés para la expresión transitoria (en este ejemplo Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG y el vector vacío como control) mediante agitación (200 rpm) en cultivo líquido (medio L con los antibióticos apropiados) a 28 ° C hasta fase estacionaria.
    2. Recoger y sedimentar agrobacteria por centrifugación (3000 × g durante 5 min). Desechar el sobrenadante y resuspender agrobacteria sedimentadas en tampón de infiltración.
    3. Medir la cantidad de agrobacterias mediante la obtención de la densidad óptica (DO) a una absorbancia de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste el OD de las bacterias a 0,1-0,8.
    4. Infiltrarse en 4 semanas de edad N. benthamiana plantas (22 ° C, 16 horas de luz) con agrobacterias por HanD (con una jeringa sin aguja 1 ml) o por vacío (añadir 0,02% v / v de agente tensioactivo).
      Nota: Utilice la primera hoja casi totalmente ampliado, y las dos hojas de inmediato mayores para la expresión de proteínas más eficaz. Para la detección de las proteínas ubiquitinadas o acetilados infiltrar hojas con 100 nM MG-132 o 100 ng / ml de tricostatina A, respectivamente, en 1 y 2 días después de la infiltración.
    5. Recoger las hojas infiltradas 2-5 días después de la infiltración y la congelación en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras en un -80 ° C congelador.
      Nota: Determine el mejor nivel de expresión de la proteína de interés con anterioridad por la toma de muestras durante un transcurso de tiempo de 5 días y detectar los niveles de proteína mediante inmunotransferencia.
  2. Para A. thaliana líneas transgénicas estables
    1. Crecer A. thaliana semillas en placas de 6 pocillos suplementado con 5 ml de medio MS líquido (1% w / v de sacarosa) por pocillo. Pon en juego tres a cinco semillas (esterilizados y estratificadas) de la línea transgénicade interés o de la línea de control no transformada por pocillo. Agitar a 200 rpm durante dos días antes de la transferencia de la placa a una cámara de crecimiento y dejar actuar durante 2 semanas (22 ° C, 10 horas de luz).
    2. Muestras de la cosecha y la congelación en nitrógeno líquido.
      Nota: Se puede utilizar como control una línea transgénica que expresa una proteína no relacionada con la misma etiqueta que la proteína de interés.
  3. Tampones
    1. Preparar Tampón A. De gas de la memoria intermedia durante 1-2 horas (para RLKs, otras proteínas unidas a la membrana y las proteínas nucleares, añadir 1% v / v de IGEPAL CA-630 53).
      Nota: Puede mantener tampón A a 4 ° C indefinidamente. Usted puede utilizar el 1% v / v Triton lugar de IGEPAL CA-360.
    2. Prepare 80 ml de tampón B frío al menos 1-2 horas antes de la extracción.
      Nota: La proporción ideal de tejido vs tampón de extracción es 1:04 (w / v).

2. Extracción de proteínas

  1. Justo antes de la extracción preparar 80 ml de tampón C. fría
    Nota: Añadir 10 M MG-132 para la detección de proteínas ubiquitinated.
  2. Moler 20 g de N. tejido benthamiana (aproximadamente 15 hojas) o A. thaliana plántulas (2-4 g por placa de 6 pocillos) en nitrógeno líquido utilizando un mortero.
  3. Añadir 80 ml de frío tampón C a los 20 g de tejido molido, mezclar bien, y descongelar en hielo.
    Nota: Moler todas las muestras al mismo tiempo (proteína de interés y el control).
  4. Homogeneizar con 3 ráfagas de 10 segundos cada uno a toda velocidad con un homogeneizador de tejidos (previamente enfriado a 4 ° C). Filtrar a través de un tejido de 22-25 micras y se centrifuga a 30.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    Nota: Como alternativa, homogeneizar con un mortero y una maja preenfriado fresco.
  5. Para los pasos de bloqueo y lavado de la matriz de afinidad, preparar 20 ml de tampón D.
  6. Bloque 100 ml de matriz de afinidad adecuada utilizando 500 ml de tampón enfriado D que contienen 1% de BSA durante 5 min a 4 ° C.
    Nota: Preferido AFmatrices Finity incluyen anti-FLAG M2 agarosa, estreptavidina agarosa, GFP-Trap_A y anti-HA agarosa.
  7. Lave 3 veces con 1 ml de frío Buffer D.
  8. Aspirar el sobrenadante del extracto de la hoja y el filtro a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un nuevo tubo en hielo.
    Nota: El color extracto debe ser de color verde o amarillo, y si la muestra ha vuelto marrón, desechar y volver a empezar.
  9. Tomar una alícuota del extracto crudo de inmunoblot, añadir 5x tampón SDS-PAGE de carga, vórtice y desnaturalizar las muestras de ebullición durante 10 minutos a 80-100 ° C en un bloque de calor.

3. La inmunoprecipitación de proteínas

  1. Dividir el extracto de proteína en dos tubos de 50 ml y añadir 50 l de la matriz de afinidad en suspensión en Tampón D a cada tubo. Incubar con rotación suave durante 2 horas a 4 ° C.
    Nota: no se han encontrado las incubaciones más largas para aumentar el rendimiento.
  2. Preparar 600 l (6x de volumen del grano de matriz de afinidad) de tampón de elución añadiendo aTampón D (concentraciones finales): 0,5% de BSA, péptidos 0,25 mg / ml BANDERA (por anti-FLAG M2 agarosa) o 10 mM D-biotina (por estreptavidina agarosa).
    Nota: La elución no se recomienda en el caso de las matrices de las buenas prácticas agrarias-Trap_A y anti-HA, así que vaya directamente a ebullición en 1x tampón SDS-PAGE de carga, paso de 3.11.
  3. Precipitar la matriz de afinidad por centrifugación a 4 ° C (5 min a 1.000 xg).
  4. Tomar una alícuota del extracto no ligado por inmunoblot, deseche el resto del sobrenadante, dejando aproximadamente 500 l en el fondo del tubo.
  5. Resuspender la solución en suspensión con una punta de gran calibre.
  6. Transferir la solución en suspensión mixta de los dos tubos a un único tubo de 1,5 ml.
    Nota: A partir de ahora, tendrá que utilizar 1,5 ml bajas en proteínas de unión a tubos de microcentrífuga.
  7. 3x pulso durante 5 segundos usando una centrífuga de sobremesa para precipitar la matriz de afinidad y eliminar el sobrenadante.
  8. Lavar 3 a 5 veces con 1 ml de tampón enfriado D. Entre los lavados precipitar el matri afinidadx tal como se describe anteriormente y descartar el sobrenadante. En el último lavado eliminar el exceso de tampón D con la aguja de una jeringa.
    Nota: Un lavado final con tampón D con 0,1% de Igepal se puede utilizar para reducir aún más la unión no específica.
  9. Eluir con 200 l de tampón de elución apropiado (por M2 anti-FLAG o estreptavidina, véase el paso de agarosa 3,2) 3x, 5 min cada vez con agitación constante.
  10. Reunir las 3 eluatos en un solo tubo. Se concentran las proteínas mediante el uso de 30 l de resina de absorción. Vortex, dejar reposar durante 5 minutos y precipitar la resina (2 min a 10.000 xg). Eliminar el sobrenadante.
    Nota: Para GFP-Trap_A y anti-HA agarosa, omita los pasos 3,9 y 3,10.
  11. Añadir 50 l de 1x tampón SDS-PAGE de carga a la matriz de afinidad precipitada o resina de absorción. Vortex y hervir durante 10 minutos a 80-100 ° C en un bloque de calor.
  12. Centrifugar la matriz de afinidad hervida o resina durante 2 min a 10.000 x g. Alícuota de 5 l de la supernatant para inmunotransferencia, y correr con otras fracciones en un ~ 10 cm de largo en gel de SDS-PAGE (Figura 2).
  13. Para la separación e identificación de proteínas fosforiladas por espectrometría de masas, cargue los 45 l restantes en un ~ 19 cm de largo en gel de SDS-PAGE, si se requiere la separación adicional (Figura 2).
    Nota: Un carril en blanco puede ser incluido entre todas las muestras para reducir la contaminación de las muestras.

4. La digestión de proteínas

  1. Teñir el gel SDS-PAGE con azul brillante de Coomassie coloidal (CCBB) mancha.
    Nota: Minimizar la manipulación del gel para reducir la contaminación con las queratinas. Asegúrese de que ninguno de los equipos o herramientas se han utilizado para inmunotransferencia u otras actividades que podrían haber dejado la contaminación residual de proteínas.
  2. Destain el gel con el lavado abundante en agua, preferiblemente O / N. Cortar la banda de interés a partir del gel con una hoja de afeitar limpia.
    Nota: Alinear el gel con el inmunoblot si necessary para localizar el área correcta. Como la fosforilación puede retrasar la migración de las proteínas en SDS-PAGE cortar el área inmediatamente por encima y por debajo de la banda de interés.
  3. Cortar la rodaja de gel en cubos de 2-4 mm (esto asegura que el gel será cubierto por soluciones en el tubo sin bloquear las puntas de pipeta). Colocar en un tubo.
  4. Estimar la cantidad necesaria para mantener el gel bien sumergido. Use esta cantidad para la derivación, la incubación con proteasa y la extracción de péptidos, y luego usar el doble de volumen de triples para el lavado.
    Nota: En un típico digerir con aproximadamente 100 l de las piezas de gel de corte, utilice 500 l solución para el lavado, 2 x 180 l para la deshidratación, 150 l de reducción, 120 l de alquilación, y 120 l para la digestión.
  5. Lave las piezas de gel 2 x 20 min (o hasta destained) mediante la adición de 50% de acetonitrilo (en bicarbonato amónico 50 mM, ABC). Pipetear fuera la solución con cuidado de no quitar piezas de gel.
  6. Deshidratar con 100% acetonitrilo durante 5 minutos y retirar el líquido libre.
    Nota: El gel debe aparecer encogida y blanco. Si persiste el color azul, incubar ya en acetonitrilo / ABC y / o a temperatura elevada (45-55 ° C).
  7. Reducir los enlaces disulfuro de la proteína mediante la adición de DTT 10 mM en agua y se incuba durante 30-45 minutos a 56 º C con agitación. Retire cualquier líquido libre.
  8. Residuos de cisteína alquilato por adición de cloroacetamida mM 55 (en mM ABC 50) durante 20-30 min (temperatura ambiente, oscuro). Retire cualquier líquido libre.
  9. Lavar piezas de gel 2 x 10 min con 50% de acetonitrilo (en mM ABC 50). Retire cualquier líquido libre.
  10. Deshidratar piezas de gel con acetonitrilo al 100% durante 5 minutos y retirar el líquido libre.
  11. Para la digestión tríptica, añadir 40 l de solución de trabajo de la tripsina (100 ng de tripsina en tampón de digestión: mm ABC 50, acetonitrilo 5% en el caso de una banda teñida con Coomassie promedio). Permitir piezas de gel para rehidratar durante 10 min. Agregar suficiente de tampón de digestión para cubrir piezas de gel, si es necesario. Incubar a 37 º CO / N.
  12. Para detener la digestión y extraer los péptidos a partir de las piezas de gel, se añade ácido fórmico al 5% (en 50% de acetonitrilo) (añadir el mismo volumen que el volumen de la digestión). Déjelos en remojo durante 5-10 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Repetir la extracción de 3x.
  13. Seque los péptidos mediante liofilización (preferido) o un concentrador de vacío (como Speed-Vac o Savant). Almacenar a -20 º C.
  14. Envíe su muestra para la espectrometría de masas.
    Nota: Le presentamos nuestra muestra a la instalación de la espectrometría de masas en el Laboratorio Sainsbury (Norwich, Reino Unido). Protocolos en las instalaciones de espectrometría de masas varían considerablemente, pero típicamente péptidos se disuelven en ácido trifluoroacético 0,2% con 2% de acetonitrilo antes de cargar en un sistema de cromatografía líquida acoplada a electro-pulverización espectrometría de masas en tándem.

Resultados

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Se describe aquí un protocolo para la purificación de proteínas etiquetadas de estable transgénico A. thaliana líneas o después de la expresión transitoria de proteínas en N. benthamiana. Como se ilustra en la Figura 1 la purificación de la proteína objetivo está acoplada con espectrometría de masas para permitir la identificación de proteínas que interactúan y los PTM de la proteína objetivo. El protocolo ha sido diseñado para la purificación de las proteínas implicadas en la inmunidad planta y la identificación de sus PTM, pero puede ser aplicado a la purificación de cualquier proteína vegetal etiquetados.

Como ejemplo usamos la purificación del complejo Prf / Pto de N. benthamiana. El N. transgénico line benthamiana 38-12 54, que expresa 35S: Pto, fue transitoriamente transformado con 35S: Prf-FLAG y el complejo fue immunoprecipitated con anti-FLAG M2 de agarosa (Figura 2A). El immunoblots (IB) de la Figura 2Ailustran que la mayoría de la proteína objetivo (FRP), se inmunoprecipitaron. Toma de fuerza y la proteína efectora interactuar AvrPtoB se copurified con FRP y detectarse utilizando anticuerpos y análisis de espectrometría de masas (Figuras 2A y 2B). Se encontró que el Pto que copurified con Prf migró más lentamente en gel de SDS-PAGE cuando coexpressed con el efector construye 35S: AvrPto y 35S: AvrPtoB (Figura 2A). Ambas proteínas efectoras inducidas más lenta la migración de la Pto. PRF-interacción (Figura 2A). Este efector reconocimiento dependiente de lenta migración de Pto. fue atribuido previamente a la fosforilación, ya que podría ser eliminado por tratamiento con fosfatasa 44. Para detectar los sitios de fosforilación que contribuyen a la lenta migración de Pto, hemos sometido el copurifying Prf Pto de análisis de espectrometría de masas. A pesar de la alta expresión de Pto y su fácil detección con inmunoblots podríamos recuperar péptidos covering sólo el 57% de la secuencia de Pto y no han identificado sitios de fosforilación (Figura 2B).

Posteriormente, cambiamos las estrategias para orientar la proteína Pto con anti-FLAG. N. plantas benthamiana WT fueron transitoriamente transformadas con 35S: PRF-3HA y 35S: Pto-FLAG, con o sin 35S: AvrPto y 35S:. AvrPtoB La cantidad total de proteína por toma, que comprende tanto acomplejado Prf la y las formas libres, fue inmunoprecipitada con anti-FLAG M2 de agarosa y se sometió a fraccionamiento de SDS-PAGE, en-gel de la digestión tríptica y análisis de espectrometría de masas (Figura 2C). Con este enfoque se identificaron péptidos Pto abarcan aproximadamente el 80% de su secuencia y una interacción proteína desconocida 100 kDa. Hemos identificado un conjunto de sitios individuales y dobles de fosforilación de péptidos 187-202 y 188-202 Pto (Tabla 1). Ser-198 y Thr-199 fueron los sitios de fosforilación predominantes pero aparte phoTambién se detectaron sitios sphorylation (Tabla 1). Lo más importante es doble fosforilación en Ser-198 y Thr-199 fue identificado solamente en la presencia de cualquiera de las proteínas efectoras (Tabla 1). Recientemente hemos identificado un conjunto similar de sitios de fosforilación Pto e ilustró la importancia del evento de doble fosforilación para la señalización 47. Siguiendo el protocolo descrito aquí hemos sido capaces de identificar los cambios dinámicos en el estado de fosforilación de la proteína diana.

figure-results-1
Figura 1. Diseño experimental general. La proteína diana para la inmunoprecipitación (IP) se etiqueta y se expresa en planta, transitoriamente en Nicotiana benthamiana o de forma estable en Arabidopsis thaliana. Después de la extracción de proteínas de laproteína diana se inmunoprecipitó con una matriz de afinidad. Las proteínas se separaron en un gel de acrilamida por electroforesis. Gel bandas se escindieron. Las proteínas se extraen de las bandas de gel y se sometieron a espectrometría de masas. Se identifican los sitios de fosforilación y proteínas que interactúan. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Figura 2. Prf y Pto inmunoprecipitación. A). El constructo 35S: PRF-FLAG se expresó transitoriamente en línea (38-12 35S: PTO) junto con el vector vacío (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB. Tres días después de la infiltración Prf se immunoprecipitated utilizando matriz de afinidad anti-FLAG. ImmuSe realizaron noblots (IB) para Prf, AvrPtoB y Pto. Como se ha señalado por las flechas en la parte inferior del panel de inmunoblot Pto, AvrPto y AvrPtoB inducen una migración lenta de Pto. B). El constructo 35S: PRF-FLAG se expresó transitoriamente en línea (38-12 35S: PTO) junto con el vector vacío (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB. Tres días después de la infiltración de PRF se inmunoprecipitó usando agarosa anti-FLAG y se separó en SDS-PAGE. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie coloidal (CCBB) y el Prf visible, toma de fuerza y ​​AvrPtoB proteínas bandas fueron extirpados del gel y se analizaron por espectrometría de masas. La cobertura péptido porcentaje de secuencias Pto y Prf identificados por espectrometría de masas se indica. C). Las construcciones 35S: PRF-3xHA y 35S: Pto-FLAG se expresaron transitoriamente junto con 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto o vector vacío (EV) en N. benthamiana. Tres días después de la infiltración de la cantidad total dePto-FLAG se immunoprecipitated utilizando anti-FLAG agarosa y se resolvieron en SDS-PAGE. El Pto visible y Pto-que interactúan las bandas de proteínas fueron extirpados del gel y se analizaron por espectrometría de masas. Pto y la banda de proteína de 100 kDa Pto-que interactúan son claramente visibles en el coloidal Coomassie azul brillante (CCBB) de gel de colores, mientras que el PRF es un poco menos visible (como indican las flechas). IP: inmunoprecipitación; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant coloración azul; CCBB: coloidal Coomassie Brilliant tinción azul. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Prf
EV AvrPto AvrPtoB
Péptido Pto 188-202
GTELDQ [p T 195] HLSTVVK 1 1 0
GTELDQTHL [p S 198] TVVK 10 7 5
GTELDQTHLS [p T 199] VVK 8 3 4
G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK 0 1 2
GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 8 4
GTELDQTHLSTVVK 46 26 48
Péptido Pto 187-202
KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK 0 1 0
KGTELDQTHL [p S 198] TVVK 17 17 12
KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4 2 2
KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK 0 1 1
KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 7 5
KGTELDQTHLSTVVK 21 37 18
Los péptidos 187-202 y 188-202 83 88 50
Porcentaje de péptidos con dos eventos de fosforilación 0% 26.9% 11,2%
Cobertura Secuencia Pto 78% 79% 82%

Tabla 1 doble fosforilación de un péptido Pto tras la activación de la señalización 35S:.. Prf-3xHA y 35S: Pto-FLAG se expresaron transitoriamente junto con empty vectoriales (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB en N. benthamiana. Tres días después de la infiltración de la cantidad total de proteína Pto-FLAG se immunoprecipitated utilizando matriz de afinidad anti-FLAG y se resolvió en SDS-PAGE. Las bandas visibles de Pto del coloidal Coomassie brillante gel teñido con azul se extrajeron y analizaron con espectrometría de masas. Se indica el número de péptidos identificados Pto con 0, 1, y 2 eventos de fosforilación.

Tabla de tampones
Medio L Triptona 10 g / l
Extracto de levadura 5 g / l
NaCl 5 g / l
D-glucosa 1 g / L
Tampón de Agro-infiltración MgCl 2 10 mM
MES 10 mM
Ajustar el pH a 5,5
Acetosiringona (opcional) 150 M
Tampón A Tris-HCl, pH 7,5 150 mM
NaCl 150 mM
EDTA 5 mM
EGTA 2 mM
Glicerol 5% (v / v)
Tampón B Tampón A
PVPP 2% (w / v)
Tampón C Tampón B
Ditiotreitol (DTT) 10 mM
Inhibidor de la proteasa cóctel Plant 1% (v / v)
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM
Calyculin 50 nM
El fluoruro de sodio (NaF) 50 mM
Molibdato de sodio (Na 2 Moo 4) 10 mM
Ortovanadato de sodio 1 mM
Ácido ocadaico 100 nM
Tampón D Tampón C sin PVPP
Tampón de carga 5x SDS-PAGE Tris-HCl, pH 6,8 60 mM
SDS 2%
Glicerol 0,15%
Azul de bromofenol 0,10%
TDT (añadir justo antes de su uso) 50 mM

Tabla 2. Buffer y las recetas de los medios.

Discusión

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Elucidar el mecanismo de la activación del receptor por el PAMP y efectores puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión de la inmunidad de las plantas. En los últimos 20 años, híbrido de dos pantallas genéticas y levaduras han sido fundamentales para el descubrimiento de derechos y responsabilidades parentales y las proteínas NB-LRR. Más recientemente, los protocolos basados ​​en espectrometría de masas se han establecido para la identificación de proteínas reguladas diferencialmente durante inmune de señalización 55-58, sus PTM 11,33,59,60, la composición de los complejos inmunes 61 y efector se dirige a 62. Aquí se describe un protocolo sencillo para la identificación de PTM que regulan la activación de los complejos inmunes.

En comparación con los protocolos descritos anteriormente, este protocolo permite la identificación detallada de los cambios dinámicos de la PTM. Protocolos de los enfoques de la proteómica a gran escala pueden identificar PTM de proteínas, pero no son capaces de revelar la plasticidad sitio de PTM debido a limitared cantidades de proteína. En el caso de la fosforilación de proteínas, proteómica enfoques a gran escala típicamente sólo identifican los sitios de fosforilación predominantes 11,33,59. La caracterización detallada de un estado de fosforilación de la proteína requiere una cantidad sustancial de proteína que se puede obtener sólo a través de la purificación parcial de la proteína diana 47. El protocolo descrito aquí parejas un enfoque de purificación de proteína que produce una cantidad sustancial de la proteína diana, con el análisis de espectrometría de masas de la proteína purificada. Siguiendo este protocolo, el evento de fosforilación única de Pto se atribuyó principalmente a la Ser-198 como se ha descrito previamente 52, pero algunos espectros de espectrometría de masas también apoyó un solo evento de fosforilación en Thr-195 o Thr-199. Cuando se observaron eventos dobles de fosforilación de toma de fuerza, la combinación predominante de aminoácidos fosforilados fue Ser y Thr-198-199, aunque también se observaron combinaciones en otros sitios (Tabla 1). Estos resultados demuestran claramente la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas y la capacidad del protocolo descrito para caracterizar en detalle todos los posibles sitios de fosforilación.

Los pasos más importantes de este protocolo son: 1) la extracción suficiente de proteínas, 2) la protección de los PTM, y 3) la cantidad suficiente de proteína diana. En primer lugar, para la extracción suficiente de proteínas, es importante para moler el tejido en nitrógeno líquido y, posteriormente, utilizar un homogeneizador de tejidos tal como se describe en el protocolo. Si un homogeneizador de tejidos no está disponible, un mortero y mano de mortero pueden ser utilizados. También es importante usar una relación de uno a tres (o cuatro) de gramos de tejido a volumen de tampón de extracción. Este tejido para amortiguar relación y el tampón de alta fuerza que sugerimos se asegurará de que el pH se mantendrá neutral durante el proceso de extracción. Encontramos que esto es de particular importancia para A. thaliana y tomate adicionalcciones 52. Protección de PTM se puede lograr mediante la inclusión en todos los búferes de los inhibidores adecuados de enzimas que pueden eliminar PTM. También es fundamental para llevar a cabo todos los pasos a 4 ° C y para preenfriar buffers e instrumentos. Los mayores rendimientos de proteína diana se puede lograr mediante el uso de plantas que expresan la proteína en cantidades suficientes y mediante el uso de altas cantidades de tejido (aproximadamente 20 g). El paso más importante para la obtención de cantidades suficientes de proteína diana está concentrando la proteína diana mediante inmunoprecipitación directa. La importancia de este paso es destacado por nuestra falta de identificación de PTM de Pto después de una inmunoprecipitación Prf debido a la cantidad limitada de coimmunoprecipitated Pto (Figura 2B). En contraste, la inmunoprecipitación directa de Pto. produjo péptidos sustancialmente más mensurables (Figura 2C) que conducen a aproximadamente 80% de cobertura de la secuencia de la proteína y la identificación de PTM (Tabla 1). También strongly recomendar el uso de epítopo-tags para inmunoprecipitación de proteínas. En comparación con anticuerpos producidos contra proteínas de la matriz epítopo de etiquetas de afinidad nativa puede producir cantidades más altas de proteína parcialmente purificada. Mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína nativa Pto 51 (Figura 2) para la inmunoprecipitación, hemos sido capaces de identificar sólo la fosforilación único de los dos sitios de fosforilación predominantes de Pto.

Este protocolo ha sido desarrollado principalmente para la purificación parcial de N. benthamiana proteína citoplasmática y la posterior identificación de sus sitios de fosforilación. Sin embargo, el uso de las modificaciones descritas en el presente documento, este protocolo se puede adaptar fácilmente para A. proteínas thaliana y proteínas unidas a la membrana. El principal objetivo de este protocolo es para producir suficientes cantidades de la proteína diana para la identificación de los PTM y no para lograr la máxima pureza del complejo. Si mayor purezade se requiere el complejo una segunda etapa de purificación se puede añadir a este protocolo 52. En ese caso, un primer paso permitirá a la elución de la proteína diana a partir de la matriz de afinidad sin el uso de sales de ácido o altas y la etapa posterior puede implicar una matriz, lo que requiere condiciones de elución duras. Es importante destacar que sólo hemos probado este protocolo para la identificación de sitios de fosforilación y que actualmente estamos probando su capacidad para la identificación detallada de PTM adicionales.

Nuestros resultados representativos demuestran claramente la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas y la capacidad del protocolo descrito para caracterizar sitios de fosforilación. Lo más importante, ponen de relieve que la identificación de sitios de fosforilación que confían en baja cantidad de proteínas por espectrometría de masas y por mutaciones puntuales de sitios auto-fosforilación puede dar resultados confusos. Mostramos aquí y anteriormente 47 Que la doble fosforilación de Pto. en Ser y Thr-198-199 se asocia con la activación del complejo PRF / Pto. En contraste, los resultados publicados anteriormente 47,63 han demostrado que las mutaciones de un solo punto de Ser-198 y Thr-199 a alanina, que impiden la fosforilación en estos sitios, son capaces de señalización lo que sugiere que la fosforilación de estos sitios no es un requisito previo para la activación compleja . Estos resultados pueden explicarse ahora por la fosforilación del sitio secundario Thr-195. Visión similar a la plasticidad sitio de fosforilación de otra proteína quinasa puede obtenerse siguiendo este protocolo. Además, un enfoque combinado usando sitios de fosforilación de mutaciones puntuales, las proteínas que pueden inhibir quinasas específicas (efectores), junto con la inmunoprecipitación de proteínas y análisis de espectrometría de masa dará lugar a una mejor comprensión de la importancia evolutiva de la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas.

Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto (financieros u otros).

Agradecimientos

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VN es apoyada por la Royal Society. JPR es un Fellow futuro Consejo de Investigación Australiano (FT0992129). Damos las gracias a la Dra. Miriam Gifford para la lectura crítica del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MgCl2SigmaM8266
MESSigmaM8250
AcetossiringonaSigma D134406tóxico - 1 M de stock en jeringa DMSO
ml estérilTerumo
NN-2525R
Silwet L-77 (tensioactivo)Lehle SeedsVIS-01
tóxico MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)SigmaC22111 M stock en DMSO, almacenar a -80 ° C
Sales MS SigmaM5524oxidante, tóxica
SacarosaSigma16104
Trizma baseSigmaT1503ajustar el pH con 1 N HCl para hacer 1 M Tampón Tris-HCl
NaClSigmaS30145 M culata
EDTASigmaE6758tóxico - 0,5 M culata
EGTASigmaE4378
GlicerolNational DiagnosticsEC-606
IGEPAL CA-630SigmaI8896PVPP corrosivo
(polivinilpolipirrolidona)SigmaP5288no confundir con PVP
DTT (DL-ditiothreitol)Sigma43815tóxico - 1 M de existencias, almacenar a -20 & deg; C
Cóctel de inhibidores de la proteasa vegetalSigmaP9599no congelar/descongelar demasiadas veces
PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo)SigmaP7626corrosivo, tóxico
Calicilina ATecnología de señalización9902
Fluoruro de sodio (NaF)SigmaS7920tóxico - 1 M stock
Molibdato de sodio (Na2MoO4)SigmaS66460.5 M Stock
Ortovanadato de sodio (Na3VO4)Sigma450243tóxico - Prepare una solución de 200 mM de ortovanadato de sodio. Ajuste el pH a 10.0 usando 1 N NaOH o 1 N HCl. El pH inicial de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con la gran cantidad de producto químico. A pH 10.0 la solución será amarilla. Hervir la solución hasta que se vuelva incolora (aproximadamente 10 min). Deje enfriar a temperatura ambiente. Vuelva a ajustar el pH a 10.0 y repita los pasos 3 y 4 hasta que la solución permanezca incolora y el pH se estabilice en 10.0.
Ácido okadaicoSanta Cruz Biotechnologysc-3513
Kinematica Polytron homogeneizador de tejidosFisher Scientific08-451-320
MiraclothMerck Millipore475855-1R
anti-FLAG M2 agarosaSigmaA2220esta matriz se recomienda
Estreptavidina-agarosaThermo-Scientific20347esta se recomienda
la matriz GFP-Trap_AChromotekgta-20esta matriz se recomienda
Anti-HA-AgaroseSigmaA2095esta matriz se recomienda
0.45 μ filtro mVWR513-1902
BSASigmaA7906
FLAG péptidoSigmaF3290
D-biotinaSigma47868
Resina StrataCleanAgilent400714esta resina de absorción está recomendada para la precipitación de proteínas
Mini-PROTEAN Tetra CellBiorad
PROTEAN II XL CellBiorad
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060se recomienda esta tinción
Tubos de baja unión a proteínas (LoBind)Eppendorf0030 108.116se recomiendan estos tubos
Bicarbonato de amonio (ABC)Sigma9830tóxico
AcetonitriloVWR83639tóxico, inflamable
2-cloroacetamidaSigma22790tóxico
TripsinaPromegaV5280irritante, sensibilizante
Ácido fórmicoSigma14265tóxico, corrosivo
Sonicador de baño de aguaUltravaweUltra BT Baño
LTQ-Orbitrap XLThermo-Scientific
Trichostatin ASigmaT8552tóxico
1 Aguja de jeringa Terumo celular ultrasónico

Referencias

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