Estudio de la Migración celular en Canales Microfabricated

Resumen

Un método cuantitativo para estudiar la migración espontánea de las células en un microambiente confinado unidimensional se describe. Este método tiene la ventaja de canales microfabricados y se puede utilizar para estudiar la migración de gran número de células bajo diferentes condiciones en los experimentos individuales.

Resumen

El método aquí descrito permite el estudio de la migración de células en condiciones de confinamiento en una dimensión. Se basa en el uso de canales microfabricados, que imponen un fenotipo polarizado a las células por las limitaciones físicas. Una vez dentro de los canales, las células tienen sólo dos posibilidades: seguir adelante o hacia atrás. Esta migración simplificado en el que la direccionalidad está restringida facilita el seguimiento automático de las células y la extracción de parámetros cuantitativos para describir el movimiento celular. Estos parámetros incluyen la velocidad de célula, los cambios de dirección, y las pausas durante el movimiento. Los microcanales son también compatibles con el uso de marcadores fluorescentes y son por lo tanto adecuados para estudiar la localización de los orgánulos y las estructuras intracelulares durante la migración celular en alta resolución. Por último, la superficie de los canales se puede funcionalizar con diferentes sustratos, lo que permite el control de las propiedades adhesivas de los canales o el estudio de Haptotaxis. En resumen, el sistema de hERE descrito está destinado a analizar la migración de grandes números de células en condiciones en las que se controlan tanto la geometría y de la naturaleza bioquímica del medio ambiente, lo que facilita la normalización y reproducibilidad de los experimentos independientes.

Introducción

La migración es una función celular complejo que es importante para muchos procesos fisiológicos en los organismos multicelulares, incluyendo el desarrollo, las respuestas inmunes, y la regeneración de tejidos. Además, determinadas situaciones patológicas tales como la invasión tumoral y la metástasis dependen de la motilidad celular ^1. Por estas razones, la migración celular se ha convertido en un importante campo de estudio en el contexto de la investigación fundamental y traslacional. In vivo, la mayoría de los tejidos se caracterizan por una rica matriz extracelular y de alta densidad celular. La migración celular, por lo tanto, en condiciones....

Protocolo

Nota importante: Este protocolo supone que el molde que contiene la forma de los microcanales deseados ya se ha hecho. Más información sobre la preparación del molde ha sido ya publicada ^10. Este protocolo también asume que la cultura los DC de la médula ósea se conoce.

1. Fabricación de chips

1. Mezclar el aceite PDMS y agente de curado en una relación en peso de 10:01 en un vaso de plástico. Mezclar ambos compuestos a fondo.
2. Fundido la mezcla en los microcanales de cojinete de molde. La altura total debe estar entre 0,5 a 1 cm.
3. Elimine las burbujas de aire en una campana de vacío d....

Resultados

En cada experimento la superficie de la PDMS se recubre con una molécula adaptada a los intereses del estudio. La figura 2 muestra los canales revestidos con una molécula fluorescente, PLL-g-PEG, antes y después de lavar (paso 2.4). Tal experimento permite el control de la homogeneidad del recubrimiento en los canales.

Después de la carga de células, microscopía de vídeo se puede realizar para seguir la migración celular. Figura 3A muestra un ejemplo de la m.......

Discusión

Aquí se describe un dispositivo compuesto de microcanales como un método para estudiar las propiedades migratorias de gran número de células en los experimentos individuales. Este sistema experimental imita las limitaciones ambientales confinados que se encuentran en los tejidos por las células migratorias endógenos. Sin embargo, al forzar la migración en una sola dimensión, que facilita el seguimiento automático de células y la extracción de los mensurables (Figura 5). También mostramos que nuestro dis.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polidimetilsiloxano (PDMS)	GE Siliconas	RTV615	Paquete de 90% de base de silicona y 10% de agente de curado
Cortador de muestras de núcleo	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diámetro 2,5 mm
Plato con fondo de cristal	WPI	Fluorodish FD 35-100
Limpiador ultrasónico	Branson Ultrasonics	Branson 200
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC 32 G	Para muestras pequeñas (35 platos). También está disponible una versión más grande
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	Aldrich F0895
PolyLysine injertado PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254