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Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

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DOI:

10.3791/51105

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17 de diciembre de 2013

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Resumen

La actividad citolítica de las células T CD8+ rara vez se evalúa. Describimos aquí un nuevo ensayo basado en células para medir la capacidad de las células T CD8+ específicas de antígeno para matar las células T CD4+ cargadas con su péptido afín. Las células T CD4+ diana se dividen en dos poblaciones, marcadas con dos concentraciones diferentes de CFSE. Una población es pulsada con el péptido de interés (CFSE-bajo) mientras que la otra permanece sin pulso (CFSE-alto). Los linfocitos T CD4+ pulsados y no pulsados se mezclan en una proporción igual y se incuban con un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ purificados. La destrucción específica de los linfocitos T CD4+ diana autólogos se analiza mediante citometría de flujo después del cocultivo con linfocitos T CD8+ que contienen los linfocitos T CD8+ efector específico del antígeno detectados mediante tinción de péptido/tetrámero MHCI. La lisis específica de los linfocitos T CD4+ diana, medida en diferentes proporciones efectoras frente a dianas, permite el cálculo de unidades líticas, LU30/106 células. Este ensayo simple y directo permite la medición precisa de la capacidad intrínseca de las células T CD8+ para matar las células T CD4+ objetivo.

Introducción

La actividad citolítica es la función principal de las células T CD8+, pero aún se mide raramente, ya que los ensayos utilizados para este propósito son engorrosos y han sido difíciles de estandarizar. La medición precisa de esta función es de suma importancia cuando se caracterizan las funciones efectoras de las células T CD8+, ya que aún no se han descrito predictores fiables de citotoxicidad efectiva mediada por células1,2. Aquí, proponemos un nuevo ensayo funcional para medir la actividad citotóxica de las células T CD8+ específicas de antígeno en las células T CD4+ diana. Se han desarrollado varios enfoques para proporcionar alternativas al estándar de oro, el ensayo de liberación de cromo. Presentamos aquí un ensayo basado en células que revela todo el proceso de matanza a medida que mide la muerte de las células diana vivas. Este método se derivó de protocolos de ensayos citotóxicos basados en citometría de flujo in vivo en ratones4,5 e in vitro en humanos6. En este protocolo, los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno contenidos en la población total de linfocitos T CD8+ se utilizan como células efectoras y los linfocitos T CD4+ autólogos se utilizan como células diana. Los linfocitos T efectores CD8+ de interés se enumeran utilizando MHCI/tetrámeros peptídicos7. La muerte de las células diana se calcula mediante la relación entre las células T CD4+ cargadas y no cargadas de péptidos. Hemos demostrado previamente que este método era reproducible, sensible, específico y no dependía del número de células efectoras dentro de la población total de linfocitos T CD8+8. Al enumerar tanto el número de células efectoras como las células diana en el ensayo de cocultivo, se puede calcular la capacidad intrínseca de las células T CD8+ para matar a las células diana y expresarla en unidades líticas9.

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Protocolo

1. Preparación de linfocitos T efectores CD8+

  1. Descongele las PBMC criopreservadas autólogas (2-3 viales de 50 x 106 células) transfiriendo el criovial de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.
  2. Lave las células llenando el tubo hasta 50 ml con RPMI completo (4 mM de L-glutamina y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina, suplementadas con 10% de FBS). Cuente las PBMC y vuelva a suspender las células a una concentración de 5 x 106/ml en RPMI completo.
  3. Añadir péptido específico (5 μg/ml) e IL-2 (10 ng/ml) a las PBMC.
  4. Establecimiento del cultivo en una placa de 96 pocillos profundos; siembre 1 ml de suspensión celular en cada pocillo.
  5. Después de 3 días de cultivo, reemplace la mitad del medio de cultivo celular con RPMI completo y fresco.
  6. Después de 6 días de cultivo, recoja todas las PBMC con pipeta multicanal y transfiera las células en un depósito estéril.
  7. Cuente, lave y vuelva a suspender las PBMC a 5 x 107/ml en el tampón de separación recomendado en tubos de fondo redondo de 14 ml. Añadir cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ humanos a 50 μl/ml de células. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir partículas magnéticas a 150 μl/ml e incubar durante 5 min.
  8. Lleve la suspensión celular hasta 7 ml agregando el tampón de separación. Proceda al aislamiento inmunomagnético de las células T CD8+ intactas colocando el tubo en el imán. Después de 5 minutos, con el tubo aún en el imán, vierta las células de interés en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Tome una pequeña alícuota y tiña las células con anticuerpos contra CD3 y CD8 en 1X PBS-2% FBS durante 30 min a 4 °C. La pureza de las células T CD8+ se puede medir mediante citometría de flujo con una pureza esperada del 95% o superior.
  9. Resuspenda las células T CD8+ en 450 μl con RPMI completo.
  10. Agregue 225 μl de RPMI completo en 5 tubos con tapón de rosca.
  11. Prepare diluciones seriadas (de 1:2 a 1:32) transfiriendo 225 μl de CD8+ al siguiente tubo (ver Figura 1 panel superior).

2. Preparación de linfocitos T CD4+ diana

  1. Descongele las PBMC criopreservadas autólogas (1 vial de 50 x 106 células) transfiriendo el criovial de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.
  2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de RPMI.
  3. Lave las células y vuelva a suspender las PBMC a 5 x 107/ml con tampón de separación en tubos de fondo redondo de 14 ml. Añadir cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos a 50 μl/ml de células. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir partículas magnéticas a 100 μl/ml e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lleve la suspensión celular hasta 7 ml agregando tampón de separación. Proceda al aislamiento de las células T CD4+ colocando el tubo en el imán. Después de 5 minutos, con el tubo aún dentro del imán, vierta las células deseadas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Tome una pequeña alícuota y tiña las células con anticuerpos contra CD3 y CD4 en 1x PBS-2% FBS durante 30 min a 4 °C. La pureza de las células T CD4+ se puede medir mediante citometría de flujo con una pureza esperada del 95% o superior.
  5. Cuente las células T CD4+, divídalas en dos tubos cónicos de 15 ml y lávelas con 1x PBS tibio.
  6. Prepare una solución de trabajo de 0,4 μM de alto CFSE en PBS caliente.
  7. Prepare una solución de trabajo de 0,04 μM con bajo contenido de CFSE diluyendo una porción de la solución de trabajo con alto contenido de CFSE 10x en PBS tibio.
  8. Vuelva a suspender las células a 20 x 106/ml de PBS (si el número de células T CD4+ es inferior a 10 x 106/ml, resuspenda las células en 0,5 ml de PBS) y tiña la mitad de las células T CD4+ añadiendo un volumen igual de 0,4 μM de solución de trabajo con alto contenido de CFSE (concentración final de 0,2 μM). Por ejemplo, para 1 ml de células, agregue 1 ml de la solución de trabajo CFSE. Teñir la mitad restante del CD4+ añadiendo un volumen igual de 0,04 μM de solución de trabajo baja en CFSE (concentración final de 0,02 μM). Tiñir las células durante 15 min a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.
  9. Después de la incubación, las células de pellets a 1.500 rpm durante 5 min y resuspender en 1 ml de RPMI completo caliente para apagar la reacción de etiquetado.
  10. Pulsar las células T CD4+ con CFSE bajo añadiendo el péptido de interés a una concentración final de 5 μg/ml en el RPMI completo e incubar durante 45 min en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C.
  11. Lave las células T CD4+ con CFSE alto y CFSE bajo en RPMI completo. Repita para un total de dos lavados. Vuelva a suspender a una concentración de 2 x 105 células/ml cada una en RPMI completo.
  12. Mezcle las dos poblaciones objetivo en una proporción de 1:1 (CFSE-Alto:CFSE-Bajo) (consulte el panel inferior de la Figura 1).

3. Cocultura

  1. De cada dilución de linfocitos T CD8+, siembre 100 μl por duplicado en una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
  2. Añadir los linfocitos T CD4+ diana mezclados (100 μl) a cada dilución de células efectoras hasta obtener un volumen final de 200 μl.
  3. Para medir la apoptosis basal, siembre 3 pocillos solo con células objetivo.
  4. Incubar el cocultivo durante 6 horas en una atmósfera con 5% de CO2 a 37 °C.

4. Tinción y adquisición de citometría de flujo

  1. Transfiera las células a una placa de 96 pocillos con fondo en V y tiña con tetrámeros pMHC conjugados con PE durante 15 min en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C.
  2. Lavar en 1x PBS-2% FBS y teñir las celdas con celda muerta fijable Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 durante 30 min a 4 °C, protegido de la luz.
  3. Lave las células una vez con 1x PBS-2% FBS y vuelva a suspender en 100 μl con formaldehído al 2% en 1x PBS.
  4. Adquiera células en el citómetro de flujo.

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Resultados

El esquema de la Figura 1 resume el ensayo. Los linfocitos T CD8+ purificados (células efectoras) se reconstituyeron en 450 µl de RPMI completo y se realizaron diluciones seriadas añadiendo 225 µl de células T CD8+ al siguiente tubo que contenía 225 µl de medio (panel superior). Se contaron los linfocitos T CD4+ purificados, se dividieron en dos tubos y se marcaron con dos concentraciones diferentes de CFSE (alta y baja), tal como se describe en el protocolo. Las células T CD4+ con CFSE bajo se sensibili...

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Discusión

El ensayo descrito aquí permite cuantificar la función principal de las células T CD8+: la actividad citolítica. La medición precisa de esta función es de suma importancia cuando se caracterizan las funciones efectoras de las células T CD8+, ya que estudios previos informaron discordancia entre esta función y la secreción de citoquinas de células T CD8+ específicas de antígeno10,11. Debido al corto tiempo de incubación del cocultivo (6 horas) y al uso de células diana autólogas, existe una baja tasa de muerte ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Turismo, Comercio y Desarrollo Económico de Florida.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanasEasySep Células madre19052
Kit de enriquecimiento de células T CD8+ humanas EasySepCélulas madre19053
CellTrace Kit de proliferación de células CFSE - para citometría de flujoInvitrogenC34554
Far Red LIVE/DEAD célula muerta fijableInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 Ratón Anti-Humano CD3BD
Brilliant Violet 650 Anticuerpo CD4 AntihumanoBiolegend317435
PerCP Anticuerpo CD8 antihumanoBiolegend344707
RPMI 1640 Medio 1xVWR10-040-CV
Penicilina-Estreptomicina 100x SoluciónInvitrogen15070063
Suero Fetal Bovino - Oro, PAA Inactivado por CalorA15-252
placas de 96 pocillos; Tratado; Parte inferior en U; con tapaBD Falcon353077
25 ml de poliestireno estéril, envueltos individualmenteScientific2321-2230
Placas de pocillos de 2 ml de fondo en U estériles de 96 pocillos, estériles de 2 mlThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126), grado de investigaciónMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer, tampón de separaciónCélula madre20104
Tubo cónico de polipropileno de 15 mlBD Falcon352097
tubo de fondo redondo de 14 ml, polipropilenoBD Falcon352059
The Big Easy EasySepCélula madre18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96-pocillo; Placa inferior en V con tapaFisher12-565-481
Solución de formaldehído, reactivo ACS, 37 % en peso en H2OSigma-Aldrich252549-500ML
Microtubo con tapón de rosca de 1,5 ml, cónicoSarstedt72.692.005
557943 magnética

Referencias

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
  2. Betts, M. R., Harari, A. Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV. Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).
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