Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.
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Artículo de método
Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos
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Resumen
Resumen
Los cardiomiocitos, la célula del corazón, contienen elementos citoesqueléticos y contráctiles exquisitamente organizados que generan la fuerza contráctil utilizada para bombear la sangre. Los cardiomiocitos individuales se aislaron por primera vez hace más de 40 años con el fin de estudiar mejor la fisiología y la estructura del músculo cardíaco. Las técnicas han mejorado rápidamente para incluir la digestión enzimática a través de la perfusión coronaria. Más recientemente, el análisis de la contractilidad y el flujo de calcio de los miocitos aislados ha proporcionado una herramienta vital en el análisis celular y subcelular de la insuficiencia cardíaca. La ecocardiografía y los electrocardiogramas proporcionan información sobre el corazón solo a nivel de órganos. Existen sistemas de cultivo de células de cardiomiocitos, pero las células carecen de estructuras fisiológicamente esenciales, como sarcómeros organizados y túbulos T, necesarios para la función de los miocitos dentro del corazón. En el protocolo que se presenta aquí, los cardiomiocitos se aíslan mediante perfusión de Langendorff. El corazón se extrae del ratón, se monta a través de la aorta en una cánula, se perfunde con enzimas de digestión y se introducen células para aumentar las concentraciones de calcio. Se utiliza un software de detección de bordes y sarcómeros para analizar la contractilidad, y se utiliza un tinte fluorescente de unión al calcio para visualizar los transitorios de calcio de los cardiomiocitos estimulados eléctricamente; Aumentar la comprensión del papel que desempeñan los cambios celulares en la disfunción cardíaca. Tradicionalmente utilizado para probar los efectos de los fármacos en los cardiomiocitos, empleamos este sistema para comparar miocitos de ratones WT y ratones con una mutación que causa miocardiopatía dilatada. Este protocolo es único en su comparación de células vivas de ratones con función cardíaca conocida y genética conocida. Se comparan de forma fiable muchas condiciones experimentales, como la manipulación genética o ambiental, la infección, el tratamiento con fármacos, etc. Más allá de los datos fisiológicos, los cardiomiocitos aislados se fijan y tiñen fácilmente para los elementos del citoesqueleto. El aislamiento de cardiomiocitos por perfusión es un método extremadamente versátil, útil para estudiar los cambios celulares que acompañan o conducen a la insuficiencia cardíaca en una variedad de condiciones experimentales.
Introducción
Los cardiomiocitos proporcionan la fuerza contráctil para el corazón. Cada miocito contiene elementos citoesqueléticos y contráctiles organizados esenciales para la contracción. El corazón no solo contiene cardiomiocitos, sino también fibroblastos, tejido conectivo y miocitos modificados como las fibras de Purkinje. Los cambios en cualquiera o todos estos tipos de células se pueden observar en la insuficiencia cardíaca, lo que dificulta la determinación de la causa final de la disfunción cardíaca. La disminución de la contractilidad ventricular de un corazón debilitado está precedida por diversos grados de acumulación de tejido fibroso e hipertrofia y disfunción de lo....
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Protocolo
Asegurar que todos los procedimientos con animales son aprobados por el uso adecuado con animales y el cuidado del cuerpo.
1. Preparar Imagenes Buffers in Advance
- Prepare 2 L de stock Ca 2 + de Tyrode libre (Tabla 1). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.
- Prepare 2 L de stock 1,2 mM de Ca2 + Tyrode (Tabla 2). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.
2. En el día del experimento, Preparar perfusión, Transferencia, y Digestión Buffers
- Preparar tampón de perfusión de 150 ml de Ca 2 + de Tyrode libre (Tabla 3) y ....
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Resultados
Una vez que la contractilidad y trazados transitorios se recogen (figura 2), los datos se analizan con facilidad con el software adecuado. Todo el rastreo, o porciones de los mismos se pueden promediar (Figura 3). La contractilidad se puede analizar en una variedad de maneras. Para la función sistólica, se puede evaluar la magnitud de la contracción con la fracción de acortamiento, o la velocidad de la contracción con el tiempo hasta el pico acortamiento, y la velocidad de contracción. .......
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Discusión
Aislamiento de cardiomiocitos de calidad requiere un cierto nivel de la práctica y la optimización. Este protocolo contiene pasos clave que pueden afectar en gran medida el resultado de la digestión. Estos deben ser cuidadosamente considerados al realizar la solución de problemas y el protocolo. El tiempo desde la extracción del corazón de la canulación y la perfusión debe reducirse al mínimo, idealmente menos de cinco minutos. Enjuagar el corazón inmediatamente en tampón de perfusión enfriado con hielo después de la el.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Marc Wozniak para el uso de Departamento de la célula y el equipo videografía Biología del Desarrollo.
Universidad Vanderbilt de imágenes de células de recursos compartidos.
Este trabajo es apoyado por AHA subvención 12PRE10950005 a ERP, AHA subvención 11GRNT7690040 a DMB, NIH subvención R01 HL037675 de DMB. DMB es el Presidente Gladys P. Stahlman en Cardiovascular Research.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma | G7528 | |
| 2,3-butanodiona-monoxima (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurina | Sigma | T-0625 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Colagenasa B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Colagenasa D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Proteasa XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparina | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorano | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhidro | Sigma | 276855 | |
| Sistema de estimulación celular y análisis fluorescente IonOptix | IonOptix | ||
| 250 μ m filtro de malla de nylon | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Adaptador Luer-stub | Becton Dickinson | 1482619E | |
| Tubo PE-50 | Becton Dickinson | 427410 |
Referencias
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
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Reimpresiones y permisos
