Artículo de método

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

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DOI:

10.3791/51109

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7 de septiembre de 2014

 ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

En este artículo

Resumen

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Resumen

Los cardiomiocitos, la célula del corazón, contienen elementos citoesqueléticos y contráctiles exquisitamente organizados que generan la fuerza contráctil utilizada para bombear la sangre. Los cardiomiocitos individuales se aislaron por primera vez hace más de 40 años con el fin de estudiar mejor la fisiología y la estructura del músculo cardíaco. Las técnicas han mejorado rápidamente para incluir la digestión enzimática a través de la perfusión coronaria. Más recientemente, el análisis de la contractilidad y el flujo de calcio de los miocitos aislados ha proporcionado una herramienta vital en el análisis celular y subcelular de la insuficiencia cardíaca. La ecocardiografía y los electrocardiogramas proporcionan información sobre el corazón solo a nivel de órganos. Existen sistemas de cultivo de células de cardiomiocitos, pero las células carecen de estructuras fisiológicamente esenciales, como sarcómeros organizados y túbulos T, necesarios para la función de los miocitos dentro del corazón. En el protocolo que se presenta aquí, los cardiomiocitos se aíslan mediante perfusión de Langendorff. El corazón se extrae del ratón, se monta a través de la aorta en una cánula, se perfunde con enzimas de digestión y se introducen células para aumentar las concentraciones de calcio. Se utiliza un software de detección de bordes y sarcómeros para analizar la contractilidad, y se utiliza un tinte fluorescente de unión al calcio para visualizar los transitorios de calcio de los cardiomiocitos estimulados eléctricamente; Aumentar la comprensión del papel que desempeñan los cambios celulares en la disfunción cardíaca. Tradicionalmente utilizado para probar los efectos de los fármacos en los cardiomiocitos, empleamos este sistema para comparar miocitos de ratones WT y ratones con una mutación que causa miocardiopatía dilatada. Este protocolo es único en su comparación de células vivas de ratones con función cardíaca conocida y genética conocida. Se comparan de forma fiable muchas condiciones experimentales, como la manipulación genética o ambiental, la infección, el tratamiento con fármacos, etc. Más allá de los datos fisiológicos, los cardiomiocitos aislados se fijan y tiñen fácilmente para los elementos del citoesqueleto. El aislamiento de cardiomiocitos por perfusión es un método extremadamente versátil, útil para estudiar los cambios celulares que acompañan o conducen a la insuficiencia cardíaca en una variedad de condiciones experimentales.

Introducción

Los cardiomiocitos proporcionan la fuerza contráctil para el corazón. Cada miocito contiene elementos citoesqueléticos y contráctiles organizados esenciales para la contracción. El corazón no solo contiene cardiomiocitos, sino también fibroblastos, tejido conectivo y miocitos modificados como las fibras de Purkinje. Los cambios en cualquiera o todos estos tipos de células se pueden observar en la insuficiencia cardíaca, lo que dificulta la determinación de la causa final de la disfunción cardíaca. La disminución de la contractilidad ventricular de un corazón debilitado está precedida por diversos grados de acumulación de tejido fibroso e hipertrofia y disfunción de los cardiomiocitos1. Las arritmias pueden ser causadas por una disfunción en las células conductoras2, fibrosis que interrumpe la conducción cardíaca3 o cambios en la expresión de canales iónicos en cardiomiocitos1,4. De hecho, estos problemas a menudo coexisten de una manera complicada.

Aislar y estudiar los cardiomiocitos permite examinar la disfunción contráctil y eléctrica de los miocitos individuales en el contexto de la función cardíaca general. Las técnicas para aislar miocitos cardíacos individuales se desarrollaron hace más de 40 años en un esfuerzo por estudiar mejor la fisiología de esta célula "caballo de batalla" del corazón. Las técnicas de aislamiento han sido mejoradas para aumentar el rendimiento y la calidad de las células, con el desarrollo vital de la perfusión coronaria a través de la canulación de la aorta, realizada por primera vez en 19705. Este artículo describe el aislamiento de cardiomiocitos seguido de la medición de la contractilidad y los transitorios de calcio utilizando fluorescencia radiométrica y software de adquisición de datos de dimensionamiento celular. Tanto en modelos genéticos como ambientales de enfermedades cardíacas, el uso de este protocolo proporciona información clave sobre la contractilidad celular, la contractilidad y relajación sarcomérica, los transitorios de calcio y la alteración del citoesqueleto. Este sistema se utiliza a menudo para probar el efecto de los fármacos sobre los cardiomiocitos aislados6,7. Empleamos el sistema para comparar la contractilidad y los transitorios de calcio de los cardiomiocitos entre ratones de tipo salvaje y ratones con una mutación que conduce a la miocardiopatía dilatada.

El estudio de los miocitos cardíacos individuales tiene numerosas ventajas sobre otros métodos comúnmente utilizados para estudiar la anatomía y la fisiología cardíacas. La ecocardiografía y la electrocardiografía proporcionan información sobre la función contráctil y la conducción eléctrica del corazón en general. Ninguno de estos métodos explica la causa o la naturaleza de la disfunción por debajo del nivel de todo el órgano. La medición de la contractilidad de los cardiomiocitos individuales mediante algoritmos de detección de bordes y longitud de sarcómeros puede demostrar que los cambios dentro de la célula contráctil del corazón están presentes dentro de la disfunción cardíaca global. La medición de los transitorios de calcio demuestra la influencia de los cambios en el flujo iónico a nivel celular en la disfunción contráctil o arritmias.

Además de complementar los estudios de órganos completos, este protocolo proporciona células fácilmente teñibles para los componentes subcelulares. Es posible ver cambios en el citoesqueleto al teñir secciones de tejido de todo el corazón; Sin embargo, solo se puede visualizar una sección transversal de las células. Un cardiomiocitos completo es más grueso que la sección típica de tejido y, dada la disposición y la longitud de los cardiomiocitos, es difícil ver células enteras en una sola sección. Los cardiomiocitos aislados se pueden fijar inmediatamente y teñir para una variedad de elementos citoesqueléticos y canales iónicos. Las imágenes confocales se pueden compilar en pilas z de espesor completo de la celda. Además, la tinción de miocitos cardíacos aislados permite la tinción de componentes que son imposibles de visualizar en secciones, como las invaginaciones de la membrana conocidas como túbulos T.

Existen líneas celulares cultivadas de miocitos cardíacos, algunas de las cuales tienen perfiles transcripcionales y características fenotípicas similares a los de los miocitos cardíacos. Algunas, como la línea celular HL-1, incluso conservan cierta organización sarcomérica y una capacidad contráctil rudimentaria8. A pesar de estas cualidades, las células cultivadas carecen de la forma de "vagón de caja" y la estructura de túbulo T de los cardiomiocitos y tienen menos organización sarcomérica. Estos componentes son esenciales para la función de los cardiomiocitos in vivo. Además, el uso de células cultivadas permite la manipulación genética, pero no la manipulación fisiológica in vivo. Los cardiomiocitos aislados conservan su organización celular el tiempo suficiente para ser estudiados, pero aún así son fácilmente visualizables e incluso transducidos9.

Los cardiomiocitos aislados son extremadamente versátiles, proporcionando un sustrato para analizar células de forma idéntica en diversas condiciones experimentales. El aislamiento y el análisis fisiológico de los miocitos han sido utilizados por innumerables laboratorios para una variedad de experimentos, incluido el estudio del efecto de los medicamentos6,7 o moléculas pequeñas10, los factores estresantes ambientales11, la infección12, la enfermedad13 o la mutación genética14,15 en la contractilidad y / o los transitorios de calcio y el estudio de la regulación de la contractilidad y la liberación de calcio dentro de un cardiomiocitos15-17. Con la aplicación de cualquiera de estos factores estresantes, los cambios en la función cardíaca podrían deberse a cualquier combinación de cambios en los propios cardiomiocitos y cambios en el entorno circundante del corazón, como cicatrices, cambios en la conductividad o cambios en la matriz extracelular. Este es un protocolo ideal para responder preguntas de investigación sobre la estructura y función individual de los miocitos en el contexto de la insuficiencia cardíaca por cualquier causa.

Aunque tiene innumerables ventajas sobre otras técnicas, el análisis fisiológico de cardiomiocitos aislados no es ideal para todas las preguntas de investigación. El aislamiento es un procedimiento terminal, por lo que los cardiomiocitos solo se pueden evaluar en un momento de la vida del ratón. Esto se puede superar parcialmente utilizando cohortes y sacrificando ratones individuales a lo largo del curso del desarrollo de la enfermedad o mediante el seguimiento del ratón para determinar si tiene insuficiencia cardíaca clínicamente significativa antes del aislamiento. Aunque este protocolo puede determinar si se ha producido una disfunción de los cardiomiocitos, no se puede llegar a la conclusión de que esta disfunción es la causa principal de la insuficiencia cardíaca sin información experimental adicional. Es posible que la disfunción de los cardiomiocitos en sí misma sea secundaria a otros cambios en el corazón. A pesar de estos desafíos, el estudio de los cardiomiocitos ofrece información valiosa para determinar la naturaleza de la disfunción en el corazón, especialmente cuando se combina con otros experimentos.

El siguiente protocolo es una adaptación de uno proporcionado por el Dr. Chee Lim, de la Universidad de Vanderbilt. Aunque los datos de contractilidad y flujo de calcio son altamente reproducibles y útiles para comparar corazones con manipulación genética o ambiental, el aislamiento en sí mismo sigue siendo un protocolo dependiente de la técnica, que requiere optimización. Minimizar el tiempo entre la extracción del corazón del ratón y la perfusión del corazón a través de la canulación aórtica es esencial para una digestión de calidad. Además, el tiempo de digestión y la concentración de enzimas se pueden optimizar para obtener miocitos de la más alta calidad. A continuación se indican los pasos que probablemente requieran optimización, junto con sugerencias para la optimización.

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Protocolo

Asegurar que todos los procedimientos con animales son aprobados por el uso adecuado con animales y el cuidado del cuerpo.

1. Preparar Imagenes Buffers in Advance

  1. Prepare 2 L de stock Ca 2 + de Tyrode libre (Tabla 1). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.
  2. Prepare 2 L de stock 1,2 mM de Ca2 + Tyrode (Tabla 2). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.

2. En el día del experimento, Preparar perfusión, Transferencia, y Digestión Buffers

  1. Preparar tampón de perfusión de 150 ml de Ca 2 + de Tyrode libre (Tabla 3) y se filtra a través de un filtro de 0,2 micras.
  2. Preparar 35 ml de transferencia de Ca 2 + libre de "tampón A" (Tabla 4) y 25 ml de Ca2 + que contiene "tampón B" (Tabla 5). Filtra cada uno a través de un filtro de 0,2 micras.
  3. Preparar soluciones de 00,06, 0,24, 0,6, y 1,2 mM Ca 2 + mediante la mezcla de tampón A y B según la Tabla 6.
  4. Preparar 25 ml de tampón de digestión de enzimas de digestión por disolución en 25 ml de tampón de perfusión (Tabla 7) basado en el peso corporal (BW) del ratón. Filtrar a través de un filtro de 0,2 micras antes de su uso.

3. Configuración Experimental

  1. Montar un aparato Langendorff de flujo constante, disponibles comercialmente, o usando una bomba, tubos, y una bobina de intercambiador de calor peristáltica para permitir un caudal de 3 ml / min de perfusión se calienta a 37 ° C. Un esquema simple se proporciona en la revisión de 2011 por Bell et al 18.
  2. Conjunto de circulación temperatura del baño de agua (~ 47 ° C) del aparato Langendorff de manera que la salida de la cánula está en 37 ° C a una velocidad de flujo de 3 ml / min.
  3. Ejecutar etanol al 70% a través del sistema de perfusión durante 15 min, seguido por 100 ml de agua ultrapura tipo I. Ejecutar tampón de perfusión a través de la system durante 5 minutos, mientras que la eliminación de burbujas de aire.
  4. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con un método deseado.
  5. Crear cánula uniendo una pieza corta (aproximadamente 3 mm) de PE-50 tubo a la punta de un adaptador Luer-stub 23 T. Punta de calor de tubo para crear un labio sobre el cual se colocará la aorta.

Aislamiento 4. cardiomiocitos

  1. Inyectar ratón con 0,2 ml de solución de heparina (1.000 UI / ml), a través de inyección intraperitoneal.
  2. Después de 5 min, anestesiar al ratón con isofluorano. Cuando anestesiado por completo (sin respuesta a la fuerte pellizco pie), el pecho rociar con EtOH al 70%. Abre el cofre, extirpar rápidamente el corazón, con cuidado de no dañar la aorta, y el lugar en el 4 ° C tampón de perfusión. Utilice pinzas curvas para agarrar y levantar en el corazón. Esto crea espacio para recortar archivos adjuntos detrás del corazón con tijeras finas.
  3. Cannulate el corazón agarrando suavemente el borde de la aorta con dos pares de pinzas finas y tirando con cuidado el opening de la aorta sobre el labio de la cánula. Asegúrese de que la punta de la cánula no es allá de la válvula aórtica y en el ventrículo, ya que esto inhibir la perfusión del corazón a través de las arterias coronarias.
  4. Asegure la aorta a la cánula mediante la vinculación de un bucle de sutura de seda 5-0 alrededor de la aorta inmediatamente por encima del labio de la cánula.
  5. Nota: Los pasos 4.2 a 4.4 se debe completar lo más rápidamente posible a la mejor digestión de calidad.
  6. Nota: El corazón se puede colgar directamente en la cánula ya está fijado en el aparato Langendorff con un chorro de tampón de perfusión. Sin embargo, el corazón colgando sobre una cánula unida a una jeringa pequeña de tampón de perfusión bajo un microscopio de disección ha sido encontrado para ser más exitoso. Esto permite que una pequeña cantidad de tampón de perfusión para ser empujado a través, en busca de la limpieza de las arterias coronarias y la garantía de corazón está bien conectado a la cánula. La cánula se colgó en el Langendorff con tampón de perfusión.
  7. Perfundirel corazón con Ca 2 + tampón de perfusión libre a un caudal de 3 ml / min durante 2-3 min.
  8. Cambie a la enzima tampón de digestión y perfundir durante 7-10 minutos, el corazón se volverá más suave y de color más claro.
  9. Nota: el tiempo de digestión se puede ajustar sobre la base de la actividad enzimática y el tamaño del corazón.
  10. Una vez que el corazón es palpablemente flácida, quitar el corazón de la cánula y colocar en un plato p60 estéril con tampón A (Ca 2 + tampón de transferencia gratuita).
  11. Retire aurículas y los grandes vasos. Retire ventrículo derecho, si lo desea. Con unas pinzas, separar el ventrículo en trozos pequeños. Pipeta varias veces con una pipeta de transferencia 5 ml estéril para dispersar a más células.
  12. Se filtra la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml a través de un filtro de malla de nylon 250 m.
  13. Deje que la suspensión para que sedimenten durante aproximadamente 10 min.
  14. Transferir el sedimento en la solución 0,06 mM Ca 2 +. Permiten a las células para sedimentar durante 10 min. Las células sanas se sedimenten, mientras que la mayoría de las células muertas flotan.
  15. Aspirar el sobrenadante, y transferir el pellet a la mM Ca 2 + 0,24 solución.
  16. Repetir 10 min de incubación, la aspiración y transferir a través de los dos restantes de Ca 2 + soluciones hasta que las células están en la solución 1,2 mM. En este punto, la mayoría de las células debe ser miocitos en forma de varilla.

5. medición contractilidad y calcio transitorios

  1. Nota: Tanto la contractilidad y transitorios de calcio pueden ser medidos de forma simultánea.
  2. Preparar Fura-2 AM solución mediante resuspensión en DMSO anhidro a una concentración de 1 g / l. Solución de Fura-2 AM se puede almacenar en un desecador a -20 ° C.
  3. Cargar 1 ml de células suspendidas con 1 l Fura-2 PM. Permiten a las células para sentarse en la oscuridad 10 min y luego se aspira el sobrenadante. Lavar dos veces con solución de Tyrode Ca 2 +, permitiendo que las células de pellets en la oscuridad durante 10 min entre lavados.
  4. Coloque un cubreobjetos de vidrio en un inserto de fase que permite pe climatizadarfusion / aspiración y el electrodo de estimulación con un estimulador campo de los miocitos. Lugar etapa de inserción en microscopio invertido configurado para la medición de fluorescencia, la adición de una gota de aceite a la lente si se utiliza un objetivo de inmersión en aceite.
  5. Configure perfusión por gravedad calienta con una solución 1,2 mM Ca 2 + de Tyrode lo solución en el escenario alcanza los 37 ° C. Conecte la aspiración a vacío. Conecte los electrodos.
  6. Encienda el sistema de microscopio, y abra la fluorescencia y la adquisición de datos dimensionamiento celular software radiométrica.
  7. Añadir unas gotas de células cargadas Fura-2 am a la inserción etapa, bloqueando la perfusión momentáneamente para permitir que las células sanas se asienten.
  8. Utilice objetivo de 40X para localizar célula deseada. Una célula sana debe ser en forma de bastón y no contratar de forma espontánea. Debe visiblemente y el contrato de manera uniforme cuando la célula se estimula a 5-20 V.
  9. Nota: análisis fisiológico requiere una digestión de alta calidad. Es posible tener células con aspecto saludable, pero no lo hacen pa ce bien para análisis fisiológico. Protocolo de digestión puede requerir refinamiento para obtener alta calidad, miocitos sanos. Además, corazones mutantes o enfermos pueden requerir modificaciones en el protocolo.
  10. Adjust rotación de la lente y el cambio abertura de modo de célula deseado se alinean horizontalmente en la pantalla y el fondo no es visible.
  11. Alinear bares de detección de bordes en cada extremo del miocito y ajuste de umbral. Alinear la detección del sarcómero en una parte de la célula con sarcómeros uniformes. Cuanto más tiempo pueda hacer de este bar, más preciso será el modelo matemático de la longitud del sarcómero será, siempre y cuando no se encuentre en dos poblaciones de sarcómeros.
  12. Células Pace a 2 Hz y 5-20 V durante 10-15 segundos antes de la grabación.
  13. Trazado Record. La luz ambiente debe reducirse al mínimo para obtener el mejor registro de transitorios de calcio.

6. Análisis

  1. Analizar huellas utilizando fluorescencia radiométrica y dimensionamiento celular software de adquisición de datos.
título "> 7. Estudios Complementarios

  1. Este protocolo proporciona el exceso de células que pueden ser utilizados para una variedad de otros experimentos que incluyen: la fijación y la inmunotinción, la evaluación de los efectos directos de drogas, cultivo a corto plazo, y microscopía de fuerza atómica.

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Resultados

Una vez que la contractilidad y trazados transitorios se recogen (figura 2), los datos se analizan con facilidad con el software adecuado. Todo el rastreo, o porciones de los mismos se pueden promediar (Figura 3). La contractilidad se puede analizar en una variedad de maneras. Para la función sistólica, se puede evaluar la magnitud de la contracción con la fracción de acortamiento, o la velocidad de la contracción con el tiempo hasta el pico acortamiento, y la velocidad de contracción. ...

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Discusión

Aislamiento de cardiomiocitos de calidad requiere un cierto nivel de la práctica y la optimización. Este protocolo contiene pasos clave que pueden afectar en gran medida el resultado de la digestión. Estos deben ser cuidadosamente considerados al realizar la solución de problemas y el protocolo. El tiempo desde la extracción del corazón de la canulación y la perfusión debe reducirse al mínimo, idealmente menos de cinco minutos. Enjuagar el corazón inmediatamente en tampón de perfusión enfriado con hielo después de la el...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Marc Wozniak para el uso de Departamento de la célula y el equipo videografía Biología del Desarrollo.

Universidad Vanderbilt de imágenes de células de recursos compartidos.

Este trabajo es apoyado por AHA subvención 12PRE10950005 a ERP, AHA subvención 11GRNT7690040 a DMB, NIH subvención R01 HL037675 de DMB. DMB es el Presidente Gladys P. Stahlman en Cardiovascular Research.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NaClRPIS23020
KClSigmaP-3911
MgCl2SigmaM-8266
HEPESEM ScienceS320
NaH2PO4SigmaS5011
CaCl2· 2H2OFisherC79
D-(+)-GlucosaSigmaG7528
2,3-butanodiona-monoxima (BDM)SigmaB-0753
TaurinaSigmaT-0625
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA-7030
Colagenasa BRoche Diagnostics1-088-823
Colagenasa DRoche Diagnostics1-088-882
Proteasa XIVSigmaP-5147
HeparinaAPP Pharmaceuticals, LLC401586D
IsofluoranoButler Schein11695-6776-2
Fura-2 AMTeflabs103
DMSO – anhidroSigma276855
Sistema de estimulación celular y análisis fluorescente IonOptixIonOptix
250 μ m filtro de malla de nylonSefar AmericaLab Pak 03-250/50
23 G Adaptador Luer-stubBecton Dickinson1482619E
Tubo PE-50Becton Dickinson427410

Referencias

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