PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.
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Artículo de método
Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución
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Resumen
Resumen
El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio del desarrollo, modelado de la enfermedad, y la realización de la detección de drogas. Recientemente se ha introducido una variedad de herramientas genéticas, incluyendo las múltiples estrategias para inducir mutaciones y la generación de líneas transgénicas. Sin embargo, el cribado a gran escala está limitada por los métodos de genotipificación tradicionales, que consumen mucho tiempo y mano de obra intensiva. Aquí se describe una técnica para analizar los genotipos de pez cebra mediante PCR en combinación con el análisis de alta resolución de fusión (HRMA). Este enfoque es rápido, sensible y de bajo costo, con menor riesgo de artefactos de contaminación. La genotipificación por PCR con HRMA se puede utilizar para los embriones o los peces adultos, incluidos en los protocolos de selección de alto rendimiento.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) es un sistema modelo de vertebrados ampliamente utilizada para estudios de desarrollo y modelado de la enfermedad. Recientemente, numerosas tecnologías transgénicas y de mutación se han desarrollado para el pez cebra. Técnicas de transgénesis rápida, generalmente basados en un sistema transposón Tol2 1, se han combinado con mejores opciones de clonación para el montaje fragmento de ADN múltiple 2. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y de transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se han utilizado para dirigir los loci tanto en las células somáticas y de línea germinal en el pez cebra 3,....
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Protocolo
1. Preparación de ADN
- Preparar ADN tampón de lisis: 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Añadir fresco proteinasa K a una concentración final de 1 mg / ml en el día de uso 12.
- Colección de tejidos:
- Para el adulto clip de aleta de los pescados:
- Anestesie peces: Coloque el pescado en un 0,004% de MS-222 solución (tricaína). Espere hasta que el movimiento de enmalle se desacelera.
- Coloque el pescado en una pila de 5-10 Kimwipes y cortar un pequeño trozo de la aleta de la cola, de unos 2-3 mm, con una hoja de afeitar estéril.
- Coloque rápidamente a los peces en un tan....
- Para el adulto clip de aleta de los pescados:
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Resultados
El protocolo se puede realizar durante un solo día o separado en pasos lo largo de varios días (diagrama de flujo de trabajo se muestra en la Figura 1). La extracción de ADN es seguido por la masa fundida y el análisis de los amplicones de PCR. Las temperaturas de la masa fundida del amplicón dependen del tamaño y contenido de GC, pero generalmente comienzan y las temperaturas extremas de 50 ˚ C y 95 ˚ C son apropiadas (Figuras 2A y 2B). Una vez que se realiza la masa f.......
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Discusión
PCR combinada con HRMA es una tecnología de gran alcance para el genotipado de pez cebra. Las ventajas de este enfoque son su velocidad, robustez, y la sensibilidad para detectar incluso mutaciones puntuales. El protocolo de todo, desde el análisis hasta derretir curva fin-clip, se puede realizar en menos de ocho horas por un solo individuo. Además, la técnica es susceptible de cribado de alto rendimiento; no requiere el uso de bromuro de etidio, y se sella para todos PCR y pasos de análisis que ayuda a minimizar los pr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a los miembros de las Blaschke, Grunwald, y Wittwer laboratorios para el asesoramiento y la asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por la Fundación PCMC, NIH R01 MH092256 y DP2 MH100008, y la Fundación March of Dimes beca de investigación # 1-FY13-425, a JLB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 Reaction LightScanner Master Mix BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | |
| PCR de carcasa dura Placas BLK/WHT de 96 pocillos | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Sellos adhesivos Microseal 'B' | Bio-Rad Laboratories MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| Instrumento LightScanner de 96 pocillos | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| Software LightScanner con Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Análisis de fusión de alta resolución 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software de diseño de imprimación | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehido |
Referencias
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al.
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Reimpresiones y permisos
