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Artículo de método

Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica

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DOI:

10.3791/51154

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15 de abril de 2014

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En este artículo

Resumen

El trasplante de células madre / progenitoras neuronales (CPN) tiene grandes promesas en neurología regenerativa. La administración sistémica de NPC se ha convertido en el protocolo eficaz, de bajo invasiva, y terapéuticamente muy eficaz para entregar las células madre en el cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por daño experimental inflamatoria crónica del sistema nervioso central.

Resumen

Células madre / precursoras neuronales (CPN) son una fuente prometedora de células madre para trasplante enfoques destinados a la reparación del cerebro o la restauración de la neurología regenerativa. Esta directiva ha surgido a partir de la amplia evidencia de que la reparación del cerebro se logra después focal o sistémica trasplante de NPC en varios modelos preclínicos de enfermedades neurológicas.

Estos datos experimentales han identificado la ruta de suministro de células como uno de los principales obstáculos de terapias con células madre de restauración para enfermedades cerebrales que requiere una evaluación urgente. Intraparenquimatosa injerto de células madre representa un enfoque lógico para aquellas patologías que se caracterizan por lesiones cerebrales aisladas y accesibles, tales como lesiones de la médula espinal y la enfermedad de Parkinson. Desafortunadamente, este principio es muy poco aplicable a condiciones caracterizadas por una naturaleza multifocal, inflamatoria y diseminada (tanto en tiempo y espacio), incluyendo la esclerosis múltiple (EM). Como tal, el cerebro dirigido por el sistla entrega de la APN emic se ha convertido en un protocolo invasiva y terapéuticamente eficaz bajo para entregar las células al cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por experimental de daño inflamatorio crónico del sistema nervioso central (SNC).

Este método alternativo de suministro de células se basa en la pathotropism APN, específicamente su capacidad innata para (i) detectar el medio ambiente a través de las moléculas de adhesión de células funcionales y los receptores de citoquinas y quimioquinas inflamatorias; (Ii) cruzar las barreras anatómicas fugas después por vía intravenosa (iv). O inyección intracerebroventricular (icv); (Iii) acumular en el nivel de sitio múltiple perivascular (s) del daño cerebral y la médula espinal inflamatoria; y (iv) ejercer trófico tejido notable y efectos reguladores inmunes en diferentes células diana huésped in vivo.

Aquí se describen los métodos que hemos desarrollado para el iv. y <em> entrega icv de NPC singénicos en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como modelo de desmielinización inflamatoria crónica del SNC, y prever la entrega sistémica de células madre como una técnica valiosa para la dirección selectiva del cerebro inflamado en neurología regenerativa.

Introducción

Fuerte evidencia ha surgido a partir de los estudios in vivo que prueben la eficacia terapéutica del trasplante de células somáticas neurales madre / precursoras (NPCs) en modelos animales de trastornos del SNC 1-8. Sin embargo, una serie de cuestiones relativas a la entrega de las células madre en el huésped requiere una cuidadosa consideración antes de que estos resultados experimentales se pueden traducir en aplicaciones clínicas. Un obstáculo particularmente importante para el desarrollo de (hematopoyéticas) restaurativos terapias con células madre para enfermedades cerebrales, inflamatorias crónicas multifocales es la identificación ....

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de los animales (procedimientos científicos) Act 1986 (PPL N º 80/2457 de SP).

1. Derivación de somática Neuronales células madre / progenitoras (CPN) de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratones adultos

  1. Elaboración de instrumentos de disección y medios de comunicación
    NB: Estas dos soluciones se deben preparar 1-2 h antes de disecciones instrumentos están listos y precalentado a 37 º C por lo menos 20-30 minutos antes de s....

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Resultados

NPC derivación y caracterización
Disecciones SVZ se realizan en piscinas (n = 5-7 ratones / piscina) de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones por medio de disociación mecánica y enzimática (Figura 1A). Después de unos pocos días de cultivo en CGM, neuroesferas de libre flotación comienzan a formarse (Figuras 1A y 1B). Esferas primarias se recolectaron y mecánicamente a pases cada 4-5 DIV. Al pases, número de células vivas y muertas y se determinan el número de cé.......

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Discusión

Terapias basadas en células madre somáticas están surgiendo como una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de trastornos del SNC inflamatorias crónicas tales como MS2 11. Aunque todavía tienen que ser completamente dilucidado los mecanismos que sustentan sus efectos terapéuticos, el impacto significativo de la APN el trasplante en diferentes modelos experimentales de enfermedades neurodegenerativas ha dado lugar a la creencia de un tanto provocativa que las células madre pueden pronto ser ap.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Jayden Smith por su revisión crítica y la edición de la prueba el manuscrito. Este trabajo ha recibido el apoyo de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (NMSS, becas parciales RG-4001-A1), la italiana Asociación de Esclerosis Múltiple (AISM, concede 2010/R/31), el Ministerio de Sanidad italiano (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del acuerdo de ERC-2010-STG subvención sin el Programa Marco de la Comunidad Europea séptimo (CE) 260511-SEM_SEM y (FP7/2007-2013) en virtud de Acuerdo de subvención n * el grado; 280772 - iONE.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EBSSSigmaE2888
L-CysteinSigma AldrichC7352
PapainWorthington30H11965
EDTAFisher ScientificD/0700/50
Medio basal NeuroCult para ratonesTecnologías de células madre05700
Suplementos de proliferación NeuroCultStem Cell Technologies05701
HeparinaSigmaH3393
Factor de crecimiento básico de fibroblastosPeprotech100-18B-1000
Factor de crecimiento epidérmicoPeprotechAF-100-15-1000
Pluma/EstreptococoInvitrogen1514012
Matrigel (solución de recubrimiento)BD Biosciences354230
NeuroCult® Kit de diferenciación (ratón)Stem Cell Technologies05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
PBS de Dulbecco (DPBS) (10x) sin Ca y MgLaboratorios de PAAH15-011
Traza micoLaboratorios de PAAQ052-020
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650
Inmunofluorescencia
Suero normal de cabraLaboratorios PAAB11-035
Éter de polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-feniloSigma AldrichT8787
Anti Nestina para ratonesAbcamab11306
Anti GFAP para conejosDAKO203344
Ratón anti histonas H3 (fosfo S10) Abcamab14955
Conejo anti MAP-2Abcamab32454
Rata anti MBPAbD SEROTECMCA409S
Anticuerpo anti-O4, clon 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
Solución de montajeDAKOS3023
EAEFreund's
Adjuvant IncompleteSigma AldrichF5506
Mycobacterium tuberculosisDIFCOH37Ra
MOG(35– 55) Espikem
Biological Laboratories181
Procesamiento de tejidos
Iris rectaHerramientas de Bellas Ciencias14060-09
Pinzas romas/dobladasHerramientas de Bellas Ciencias11080-02
Cortadora de cerebrosZivic InstrumentsBSMAS005-1
Cuchillas quirúrgicasSwann-Morton324
P200, P1000 pipetas
Ketamina (Vetalar)Boehringer Ingelheim01LC0030
Xilacina (Rompun)Bayer32371
Marco estereotáxicoKOPFModelo 900
JeringaHamilton7762-04
Paraformaldehído (PFA)Sigma158127
VECTASTAIN Elite ABC KitLaboratorios VectorialesPK-6100
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Referencias

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al.

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