Method Article

Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

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1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden dar lugar a la activación del complemento que resulta en un procedimiento acelerado de aprobación a través de los receptores del complemento en el hígado (hemólisis extravascular) o bien dirigiéndose a la lisis intravascular de los glóbulos rojos. Aloanticuerpos (por ejemplo ABO) o los anticuerpos contra antígenos de glóbulos rojos (como se ve en la anemia hemolítica autoinmune, AHA) que conducen a la activación del complemento son potencialmente dañinas y pueden ser - especialmente cuando se conduce a la lisis intravascular - fatal 1. En la actualidad, la activación del complemento, debido a (auto)-anticuerpos en los glóbulos rojos se evalúa in vitro mediante el uso de la prueba de Coombs reflejando la deposición del complemento en eritrocitos o por un ensayo hemolítico no cuantitativo que refleja RBC lisis 1-4. Sin embargo, para evaluar la eficacia de los inhibidores del complemento, es obligatorio disponer de técnicas cuantitativas. Aquí se describen dos de estas técnicas. En primer lugar, un ensayo para detectar la deposición de C3 y C4 en las células rojas de la sangre que es inducida por anticuerpos en el suero del paciente es preSENTED. Para esto, el análisis FACS se utiliza con anticuerpos anti-C3 o anti-C4 marcados con fluorescencia. A continuación, se describe un ensayo hemolítico cuantitativa. Hemólisis mediada por el complemento En este ensayo, inducida por el suero del paciente se mide haciendo uso de la detección espectrofotométrica de la hemoglobina liberada. Ambos de estos ensayos son muy reproducible y cuantitativo, facilitar los estudios de activación del complemento inducida por anticuerpos.

Introduction

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Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden ser inducidos por la transfusión de glóbulos rojos que expresan un antígeno que no está presente en los glóbulos rojos receptores. Estos aloanticuerpos pueden causar reacciones hemolíticas agudas graves de transfusión debido a la activación del complemento en la siguiente transfusión 5. En la anemia hemolítica autoinmune (AHA), los pacientes tienen autoanticuerpos contra sus propios glóbulos rojos. Esto conduce a acelerado de aprobación de las células a través de la interacción de IgG unida a los glóbulos rojos con Fc gamma-receptores en los fagocitos en el bazo y / o en caso de auto-anticuerpos capaces....

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Protocol

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1. Preparación de los glóbulos rojos tratados con bromelina

  1. Glóbulos rojos Lave 0 mecanografiadas-3X con PBS 1x (centrifugación a 664 xg durante 2-5 min).
  2. Incubar 1 volumen de glóbulos rojos empaquetados con dos volúmenes de una solución de bromelina 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
  3. Se lavan las células 3 veces con 1 × PBS.
  4. Las células se pueden almacenar como una solución de 3% a 4 ° C en 1x PBS durante al menos una semana.

2. C3 y C4 deposición Análisis en glóbulos rojos por FACS

  1. Calor-inactivar la cantidad requerida de suero del paciente (u otra fuente de anticuerpo anti-RBC) por c....

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Results

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La Figura 2A muestra un gráfico de dispersión representativo de glóbulos rojos. Gating Conveniente para los glóbulos rojos individuales se puede ver en de FSC-W - FSC-Una parcela (P1). Por lo general, alrededor de 95% de los glóbulos rojos caen dentro de esta puerta de P1 (células individuales), pero cuando se utiliza un alto porcentaje de suero del paciente, esto puede caer al 70-80%, especialmente cuando el anti-RBC IgM está presente en el suero del paciente.

Los resultado.......

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Discussion

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Los ensayos anteriores son reproducibles y robusto. Ellos son fáciles de realizar y es posible llevar a cabo con muchas muestras al mismo tiempo (en una placa de 96 pocillos). Por lo tanto, este enfoque también sería adecuado para un sistema totalmente automatizado, por ejemplo, un sistema de robot de ELISA. En contraste con las técnicas utilizadas actualmente, estos ensayos son cuantitativos y esto ayudará por ejemplo, en el estudio del efecto de inhibidores del complemento. Por otra parte, la interpr.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ y DW reciben una subvención sin restricciones de Viropharma.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
BarbitalFagron0261Este producto químico está sujeto a la regulación de medicamentos.
Barbital sódicoFagron0263Este producto químico está sujeto a la regulación de medicamentos.
GelatinaMerck1.0470.0500 
Cloruro de sodioMerck1.06404.1000 
Cloruro de magnesioMerck1.05833.0250 
Cloruro de calcioMerck1.0238.0500 
Dylight 488 tinte reactivo a la aminaPierce46402 
Dylight 650 tinte reactivo a la aminaPierce62265 
y alfa; C5 (Eculizumab)Alexion Pharmaceuticals 
FACS (Canto)BDSe puede utilizar cualquier FACS que tenga los láseres adecuados.
Espectrofotómetro (por ejemplo, espectro Multiskan) Thermo Labsystems1500-193Se puede utilizar cualquier espectrofotómetro con el rango de longitud de onda adecuado
Software BD FACSDiva v 6.1.2BD643629Se puede utilizar cualquier software de análisis FACS compatible
Bromelina SanquinK1121 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

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Complement ActivationAntibody DepositionFlow CytometryHemolytic AssayRed Blood CellsC3 C4 DetectionQuantitative AnalysisSpectrophotometric DetectionPatient SerumAnti C5 Antibody

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