El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

Resumen

La neurotoxina botulínica Matriz BoTest (BoNT) ensayos de detección de purificar y cuantificar rápidamente BoNT a partir de una variedad de matrices de muestras. Aquí, se presenta un protocolo para la detección y cuantificación de BoNT a partir de matrices tanto sólidos como líquidos y demostrar el ensayo con BOTOX ®, los tomates y la leche.

Resumen

Se requiere la detección y cuantificación de la neurotoxina botulínica (NTBo) en matrices complejas precisa para la industria farmacéutica, medioambiental, y las pruebas de muestra de alimento. Se necesita prueba rápida BoNT de los productos alimenticios durante el forense del brote, el diagnóstico del paciente, y las pruebas de seguridad de los alimentos mientras que se requiere la prueba de potencia precisa para la fabricación de productos de fármacos basado en la NTBo y la seguridad del paciente. El bioensayo en ratón ampliamente utilizado para la prueba de BoNT es altamente sensible, pero carece de la precisión y el rendimiento necesario para la prueba rápida y rutinaria de BoNT. Además, el uso del bioensayo de los animales ha dado lugar a los llamados de las autoridades reguladoras de medicamentos y productos proponentes derechos de los animales en los EE.UU. y en el extranjero para sustituir el bioensayo en ratones para probar la NTBo. Varios ensayos in vitro de recambio en se han desarrollado que funciona bien con purificada de BoNT en tampones simples, pero la mayoría no han demostrado ser aplicable a prueba en matrices muy complejas. Aquí, un protocolo para la detección deNTBo en matrices complejas utilizando la matriz de ensayos BoTest se presenta. El ensayo consta de tres partes: La primera parte implica la preparación de las muestras para las pruebas, la segunda parte es un paso inmunoprecipitación usando anti-BoNT recubiertas de anticuerpos perlas paramagnéticas para purificar la NTBo de la matriz, y la tercera parte cuantifica proteolítica de la BoNT aislado actividad utilizando un reportero fluorogenic. El protocolo está escrito para las pruebas de alto rendimiento en placas de 96 pocillos utilizando matrices de ambos líquidos y sólidos y requiere alrededor de 2 h de preparación manual con tiempos de ensayo total de 4-26 horas dependiendo del tipo de muestra, la carga de la toxina, y la sensibilidad deseada. Los datos se presentan para las pruebas de BoNT / A con solución salina tamponada con fosfato, un producto farmacéutico, el sobrenadante del cultivo, 2% de leche, y tomates frescos e incluye la discusión de los parámetros críticos para el éxito del ensayo.

Introducción

Neurotoxinas botulínicas (BoNT) son las sustancias más letales conocidos, con dosis letales intravenosas humanos estiman en 3.1 ng / kg ^1,2. Siete serotipos de BoNT estructuralmente similares, etiquetadas A a la G, de existir, consistiendo cada uno en un dominio de cadena pesada responsable de la unión celular, la absorción, y la translocación en el citosol y una cadena ligera que codifica una endopeptidasa de zinc ^3-5. La exquisita toxicidad de BoNT resulta de, en parte, de su entrada obligatoria y específica en las neuronas motoras en la unión neuromuscular ^6. Una vez dentro de la neurona, la endopeptidasa de la cadena ligera escind....

Protocolo

1. Preparación de Reactivos de ensayo

1. Ditiotreitol 200x Deshielo (TDT), 10x Matrix tampón de unión (10 veces de aquí en adelante tampón de unión), 10x tampón de neutralización (alimentos o muestras de pH desequilibrados solamente), y 10 veces más BoTest tampón de reacción (10x Reacción adelante buffer) a temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos o hasta que esté completamente descongelado. Véase la Tabla 1 para obtener una lista de los tampones y reactivos utilizados en este protocolo. Consulte la Tabla 2 para una lista de materiales y equipos necesarios para este protocolo.
2. Agite los buffers descongelados dur....

Resultados

Un diagrama que resume los pasos en el protocolo descrito se muestra en la Figura 2. El ensayo requiere entre 4-26 horas en completarse, dependiendo del tipo de muestra y la sensibilidad del ensayo deseado, pero sólo ~ 2 horas de tiempo de práctica. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos y, dependiendo del tipo de prueba que se lleva a cabo, permite realizar pruebas por triplicado de hasta 20 muestras incluidas las normas por placa.

La Figura 3 muestr.......

Discusión

Este protocolo describe los procedimientos para la cuantificación de BoNT / A complejo holotoxina o Clostridium sobrenadante de cultivo en matrices complejas. El protocolo es el mismo, sin embargo, al probar otra serotipos de BoNT (por ejemplo BoNT / B, E y F) con sus respectivos ensayos Matrix ^56,60, aunque la sensibilidad del ensayo variará según los serotipos y ensayos. Este protocolo no tiene en cuenta para cada tipo de muestra posible y algunas modificaciones puede ser necesaria dependi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BoTest Matrix A Kit de detección de neurotoxinas botulínicas BioSentinel		A1015	También están disponibles kits de detección para BoNT/B y F.
Lector de microplacas de fluorescencia Varioskan Flash	Thermo Fisher Scientific	5250040	Se pueden utilizar la mayoría de las unidades basadas en monocromadores o filtros con excitación de 434 nm y capacidad de emisión de 470 nm y 526 nm.
Placa de separación magnética de cordón de 96 pocillos	V& P Scientific	VP771H Se	pueden usar otras placas magnéticas, pero la placa debe estar diseñada para separar las cuentas hacia el costado del pozo.
Lavadora de placas magnética compatible con cordones	BioTek	ELx405 VSRM	Opcional, solo se requiere para el lavado automatizado de placas. También se pueden usar otras arandelas de placa compatibles con cordones magnéticos, pero deben probarse antes de usarlas.
Microcentrífuga			Opcional, solo se requiere para muestras que necesitan centrifugación.
Mezclador de placas MixMate	Eppendorf	22674200
Agitador			Utilizado a temperatura ambiente o a 25 & grados; C Si se dispone de control
de temperatura, Comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA	Roche	4693132001	Solo se requiere para pruebas alimentarias o ambientales. Los inhibidores de la proteasa deben estar libres de EDTA.
BoNT/A	Metabiológicos		Opcional, solo necesario para fines de estandarización y cuantificación
Negro, de fondo plano Placas de 96 pocillos	Las placas de 237105 NUNC		no deben tratarse
Cinta de sellado de placas de 96 pocillos	Thermo Fisher Scientific	15036

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