Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

El objetivo del método descrito en este documento es aislar las paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) y digerir el peptidoglicano (PG) de modo que la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) se pueda utilizar para proporcionar información como la identidad de los componentes muropeptide y sus concentraciones, la longitud promedio de las hebras de glicanos y la fracción de material involucrado en los reticulados entre las hebras. Para una discusión detallada de la bioquímica pg y las especies de muropeptide, hay varias revisiones excelentes que describen la estructura pg y su papel en la infección, resistencia, morfogénesis, y el crecimiento^1-6. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para el análisis de PG fue desarrollada inicialmente por Glauner y Schwarz en la década de 1980, y más recientemente se ha mejorado y aplicado ampliamente en los laboratorios de Miguel de Pedro y Waldemar Vollmer. Los métodos anteriores utilizaron análisis de aminoácidos o cromatografía de papel, técnicas lentas y tediosas que no producen evaluaciones precisas o completas de los componentes de la pared celular.

El análisis uplc se puede implementar fácilmente en cualquier laboratorio de investigación básica que tenga acceso a una ultracentrífuga y UPLC. El método UPLC que presentamos a continuación aísla sacculi completo, proporcionando así información completa y cuantitativa sobre todas las especies químicas en él. Este método produce una cuantificación precisa de todos los muropeptides a través de una población de bacterias, todo dentro de una ejecución de UPLC de 20 minutos. La implementación de este método implica sólo habilidades básicas de laboratorio, sin una inversión financiera significativa en materiales. Para ejecutar los pasos de este método, los investigadores solo necesitan ser expertos en pipetear, preparar tampones y enzimas, y ajustar el pH, haciéndolo accesible a una amplia gama de disciplinas científicas. La elección de las enzimas utilizadas en este protocolo depende de la especie de bacteria que se está analizando; el protocolo descrito aquí es útil para Escherichia coli,y se ha encontrado generalmente para ser adecuado para aislar sacculi de otros organismos gramnegativos. La consulta con la literatura se recomienda al aplicar este método a las bacterias Gram-positivas; en estas especies, la purificación de sacculus ha sido tradicionalmente más difícil. En particular, este método puede tener que ser alterado en términos de elección de enzimas y la duración de los tiempos de digestión para acomodar las paredes más gruesas y los polímeros accesorios como los ácidos teicoicos de las bacterias Gram-positivas. La primera enzima en este protocolo escinde la lipoproteína externa de la membrana (tal como lipoproteína de Braun, o Lpp) accesorio al peptidoglycan, de tal modo liberando todo pero el C-terminal di- (o tri-) péptido del Lpp de la pared celular. Este paso es necesario al examinar enterobacterias, pero muchas otras bacterias Gram-negativas no tienen equivalentes de Lpp, y por lo tanto este paso se puede omitir. Una segunda enzima se escinde específicamente después del componente de ácido murámico del peptidoglicano, solubilizando la subunidad disacárido que forma la especie muropeptide. Para proporcionar una evaluación precisa de la arquitectura de la PG, se debe tener cuidado al digerir los sacculi para evitar la escisión de los puentes cruzados o cualquier otra parte del tallo del péptido.

Aunque las composiciones químicas de peptidoglicano de más de 100 cepas de ~ 40 especies bacterianas han sido analizadas por HPLC, no se han realizado análisis con la tecnología UPLC. Además, el trabajo anterior ha caracterizado peptidoglicano de sólo una pequeña fracción del dominio bacteriano, en parte limitado por el rendimiento de hplc. Por lo tanto, la difusión de este método a tantos investigadores como sea posible, y la implementación en las plataformas uplc, será fundamental para impulsar los estudios fisiológicos de la gran fracción de especies bacterianas cuyo peptidoglicano aún no ha sido categorizado.

1. Cultivar cultivos bacterianos en 2,5 ml de medios durante la noche

Volver a diluir los cultivos 1:100 en 250 ml de medios frescos y crecer a OD₆₀₀ de 0.7-0.8. Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio al 6% (SDS) en agua.

PRECAUCIÓN: El polvo de SDS es peligroso - evite inhalar el polvo de SDS; use una máscara sobre la nariz y la boca.

2. Día 1 - El desestecimiento de cultivos bacterianos se realiza en el transcurso de un día y durante la noche

1. Mientras que los cultivos diludos están creciendo, establezca un baño de agua hirviendo en un plato caliente en un casto de 1 L. Una vez que el agua esté hirviendo, alícuota 6 ml de SDS al 6% en tubos de polipropileno de 50 ml, agregue una pequeña barra de agitación a cada tubo, asegure las tapas del tubo apretadas a los dedos, coloque los tubos en el baño de agua y encienda la agitación a 500 rpm en la placa caliente.
2. Cosechar los cultivos de 250 ml a 5.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente y resuspend pellets en 3 ml de medio o 1x solución salina tamponada con fosfato. Pipetee lentamente las suspensiones de la célula en los tubos de 50 ml con el SDS que hierve del 6% para lyse las células (concentración final el SDS del 4%) mientras que los tubos se sumergen en el baño de agua que hierve, y vuelva a cerrar las tapas a los dedos-apretados. Las suspensiones celulares deben transferirse rápidamente a SDS hirviendo una vez resuspendidas. Se deben evitar los cambios ambientales abruptos, ya que esto podría causar una alteración errónea de la estructura de la paredcelular.
3. Cubra el baño de agua hirviendo y deje que las células hiervan durante 3 horas, comprobando el nivel del agua periódicamente y rellenando el baño de agua cuando sea necesario. Después de 3 horas, apague el elemento de calefacción de la placa caliente y continúe agitando durante la noche a 500 rpm.

3. Día 2 - Las digestiones enzimáticas se realizan en el transcurso de un día

1. Si sds se ha precipitado en los tubos de 50 ml durante la noche, establecer el baño de agua para hervir durante un adicional de 1-2 horas. Encienda un bloque de calor a 60 °C. Preparar un stock de 1 mg/ml de Pronasa E en Tris-HCl de 10 mM (pH 7,2) + 0,06% p/v NaCl y activar la Pronasa E a 60 °C durante al menos 30 min.
2. Utilice un conjunto de ultracentrífugas a 400.000 × g para hacer girar muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente con el fin de peletizar los polímeros pg grandes y así purificarlos de otros componentes celulares. Retire el sobrenadante con cuidado, y luego resuspend cada pellet en agua ultrapura a temperatura ambiente. NOTA: El volumen de resuspensión depende del volumen de los tubos ultracentrífugdos utilizados; utilice un volumen que llene los tubos al menos a mitad de camino, pero no exceda el volumen máximo de los tubos. Repita la centrifugación/lavado hasta que el agua no forme burbujas durante la resuspensión, lo que indica que la SDS se ha eliminado por completo (normalmente tres lavados). Deje de lavar el pellet si se forma un precipitado blanco, ya que esto indica que los sacculi se están agrupando. La agrupación no es catastrófica, pero los grupos se unen muy fuertemente al plástico y la cristalería causando una gran pérdida de muestras. En este caso, proceda con el protocolo utilizando la muestra de sacculi agrupada.
3. En la última etapa de centrifugación/lavado, resuspend las muestras en 900 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% p/v NaCl y transferir a 2 ml tubos previamente pinchados con agujeros en las tapas con una aguja pequeña. Añadir 100 μl de 1 mg/ml activado pronasa E (100 μg/ml de concentración final) a cada muestra e incubar a 60 °C durante 2 horas. Establezca un bloque de calor diferente a 100 °C.
4. Detenga la digestión de la Pronasa E agregando 200 μl de SDS al 6% a cada muestra y hierva las muestras en el bloque de calor de 100 °C durante 30 min. Establecer un bloque de calor diferente a 37 °C y hacer un stock de 1 mg/ml de muramidasa (mutanolisina) en tampón de fosfato de 50 mM (pH 4,9).
5. Al igual que en el paso 3.2, utilice un conjunto de ultracentrífugas a 400.000 × g para hacer girar muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente y lavar con agua ultrapura a temperatura ambiente hasta que se elimine completamente sds (normalmente tres lavados). El volumen de resuspensión depende del volumen de los tubos ultracentrífunos utilizados; utilice un volumen que llene los tubos al menos a mitad de camino, pero no exceda el volumen máximo de los tubos.
6. En la última etapa de centrifugación/lavado, resuspend muestras en 200 μl de tampón de fosfato sódico de 50 mM (pH 4,9). Este volumen se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de peptidoglicano en la muestra, y puede ser dependiente de la especie. Si existen informes previamente publicados de análisis de HPLC para las especies de interés, este volumen se puede estimar en base a estas cuantificaciones (una compilación de estudios de HPLC PG se puede encontrar en la Información suplementaria de referencia^7). Para otras especies, la preparación del sacculus se puede ejecutar hasta este paso y luego se pueden agregar diferentes cantidades de volúmenes de resuspensión para replicar muestras con el fin de determinar el volumen mínimo que permite que el PG permanezca en solución (ver Discusión para más estimaciones). Si la muestra contiene más peptidoglicano, aumente el volumen de resuspensión; si la muestra tiene poco peptidoglicano, reduzca el volumen de resuspensión a un mínimo de 50 μl.
7. Transferir muestras a tubos de 1,5 ml y añadir 1 mg/ml de muramidasa para dar una concentración final de 40 μg/ml. Incubar 6-8 horas o durante la noche a 37 °C.

4. Día 3 - La preparación de muestras para UPLC se realiza en el último día

1. Encienda un bloque de calor a 100 °C. Hervir las muestras sin SDS durante 5 min para detener la digestión muramidasa. Centrífuga muestras durante 10 min a 16.000 × g a temperatura ambiente, luego transfiera el sobrenadante (los muropeptides ahora son solubles) a tubos de vidrio de 13 mm x 100 mm. Intenta recuperar la mayor cantidad de sobrenadante posible, acercándose mucho al pellet sin molestarlo.
2. Ajuste el pH añadiendo un tampón de borato de 500 mM (pH 9) a la muestra para una concentración final de tampón de borato de 100 mM. El tampón de borato es compatible con el agente reductor borohidruro de sodio. Agregue 1-2 granos de borohidruro de sodio para reducir cada muestra y deje que la reacción continúe durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El borohidruro de sodio es altamente reactivo y peligroso de manejar: evite el contacto con la piel (use guantes) y evite el contacto con los ojos (use gafas de seguridad).
3. Ajuste las muestras a pH 3-4 (el punto isoeléctrico de muropeptide es ~3.5) con ácido ortofosfórico al 50% v/v usando incrementos de 20 μl hasta pH 6, según lo medido con papel indicador de pH, luego usando incrementos de 2 μl. PRECAUCIÓN: El ácido ortofosfórico es corrosivo y peligroso de manejar: evite el contacto con la piel (use guantes) y evite el contacto con los ojos (use gafas de seguridad). La muestra debe burbujear en respuesta a la adición de ácido ortofosfórico; cuando la muestra deja de burbujear, esto normalmente indica que se ha alcanzado un pH de 6. Si no se produce burbujeo en la muestra, esto puede indicar que la cantidad de borohidruro de sodio añadido era demasiado pequeña. En este caso, deje de bajar el pH, agregue cuidadosamente uno o dos granos de borohidruro de sodio, deje reaccionar durante 5-10 min, luego reanude el ajuste del pH.
4. Filtrar la muestra a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm directamente en un vial uplc. Si se ha formado un precipitado, caliente el tubo con varias pasadas a través de una llama antes de filtrar. Si la muestra no se inyectará en el instrumento UPLC dentro del día, congele a -20 °C durante la noche. Las muestras se pueden almacenar hasta por un año a -80 °C. La muestra se puede descongelar pasando a través de una llama varias veces.
5. Inyecte 10 μl de cada muestra en un instrumento UPLC equipado con una columna de fase invertida C18 de 1,7 μm y un detector de absorbancia configurado para monitorear 202-208 nm. Las muestras se inyectan secuencialmente, pero las capacidades del muestreador automático permiten procesar hasta 96 muestras por lotes. Use 50 mM de fosfato sódico (pH 4,35) + 0,4% v/v de azida de sodio para el disolvente A, y 75 mM de fosfato sódico (pH 4,95) + 15% v/v de metanol para el disolvente B. NOTA: Se añade azida de sodio para compensar la absorción de 205 nm de metanol para evitar la deriva basal. Ajuste el flujo a 0,25 ml/min y utilice un gradiente lineal de más de 25 min para lograr el 100% de disolvente B y la elución secuencial de muropeptides dentro de 30 min. Si la espectrometría de masas se utilizará para caracterizar muropeptides después de UPLC, recoja las fracciones del pico de interés en un colector de la fracción y seque las fracciones usando un evaporador centrífugo.

Utilizando el procedimiento descrito en la Figura 1,la muestra final debe consistir en al menos 200 μl de solución transparente que se haya filtrado directamente en un vial de UPLC (paso 4.4). La separación uplc de los diversos muropeptides en una muestra bacteriana se basa en su solubilidad relativa entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria de la columna. Las columnas C18 de fase invertida proporcionan una matriz fuertemente hidrofóbica para separar las especies de muropeptide basándose en la hidrofobicidad y el tamaño8; los monómeros polares de bajo peso molecular elute primero, y los oligómeros apolares de mayor peso molecular elute después (Figura 2). Un resultado típico de UPLC se muestra en la Figura 2,con detección a través de absorbancia UV a 202-208 nm en función del tiempo que establece el tiempo de retención de un muropeptide en particular. Este resultado representativo muestra una resolución clara entre la mayoría de las especies de muropeptide y una fuerte intensidad de la señal en todo el espectro, lo que permite el análisis y la longitud media de la hebra de glicanos.

El paso final descrito en la Figura 1 implica ajustar el pH y filtrar cualquier partícula fina que pueda obstruir las pequeñas dimensiones de la tubería utilizada en UPLC. Si una muestra se sobreconcentra, por ejemplo, reutilizando en 100 μl de tampón de fosfato sódico en el paso 3,5 en lugar de 200 μl, la muestra puede volverse turbia, lo que indica que se ha logrado una concentración crítica y que los muropeptidos se han precipitado. Esta pérdida de solubilidad resultará en la obstrucción del filtro de jeringa utilizado en el paso 4.4, evitando la deposición de muropeptides en el vial de UPLC y / o la obstrucción de los conductos y la columna de la máquina UPLC, que son elementos costosos de reemplazar. En la Figura 3se muestra un cromatograma de ejemplo que refleja este procesamiento de muestras aberrante; no se elutieron picos, lo que resulta en la ausencia de datos sobre la composición pg. Desajustar el pH a muy por debajo del punto isoeléctrico de los muropeptides(por ejemplo, a un pH de 2) también puede resultar en la precipitación de muropeptides y, por lo tanto, la ausencia de picos discernibles en el análisis de UPLC.

Figura 1. Esquema de preparación de sacculi. Este método se basa en rondas iterativas de ultracentrifugación para purificar sds lejos de los sacculi peletizado.

Figura 2. Ejemplo de cromatograma UPLC de PG a partir de sacculi digeridos a partir de células E. coli MG1655. Tenga en cuenta que la resolución comparable de todos los muropeptides se logra en el 10% del tiempo de una ejecución típica de HPLC. Etiquetas de Muropeptide - M = monómero, D = dímero, T = trímero; (2,3,4,5) indican el número de péptidos de tallo de aminoácidos; modificaciones - G = glicina que substituye la L-alanina, L = dos aminoácidos adicionales de la hendidura de la pronasa E, D = ácido diaminopimelic 3,3 (DAP) - crossbridge del DAP, N = anhydro-muropeptide de terminación. Por ejemplo, D33DL es un dímero con péptidos de tallo 3-aa, unidos a través de un puente transversal DAP-DAP, que contiene dos aminoácidos adicionales de la escisión de la pronasa E.

Figura 3. Análisis fracasado de UPLC de los sacculi digeridos de las células de E. coli MG1655. La ausencia de picos, lo que indica que no había muropeptides presentes en la muestra, se debe a que los muropeptides se estrellan fuera de la solución antes de la extracción en un vial de UPLC (paso 4.4). Esta precipitación puede haber sido debido a la sobreconcentración de los muropeptides o a que el pH es demasiado bajo.

Los costos de producción de este artículo fueron patrocinados por Waters Corporation.