La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.
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Artículo de método
Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento
En este artículo
Resumen
Resumen
La pared celular bacteriana es crítica para la determinación de la forma celular durante el crecimiento y la división, y mantiene la integridad mecánica de las células frente a presiones de turgencia de varias atmósferas en magnitud. A través de las diversas formas y tamaños del reino bacteriano, la pared celular se compone de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos cortos. La importancia central del peptidoglicano para la fisiología bacteriana subyace a su uso como diana antibiótica y ha motivado estudios genéticos, estructurales y biológicos celulares de cómo se ensambla robustamente durante el crecimiento y la división. No obstante, las investigaciones extensas todavía se requieren caracterizar completamente las actividades enzimáticas dominantes en síntesis del peptidoglycan y la composición química de paredes celulares bacterianas. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un poderoso método analítico para cuantificar las diferencias en la composición química de las paredes de las bacterias cultivadas bajo una variedad de condiciones ambientales y genéticas, pero su rendimiento a menudo es limitado. Aquí, presentamos un procedimiento sencillo para el aislamiento y la preparación de paredes celulares bacterianas para análisis biológicos de peptidoglicano a través de HPLC y Cromatografía Líquida de Ultra Rendimiento (UPLC), una extensión de HPLC que utiliza bombas para entregar presiones ultra altas de hasta 15,000 psi, en comparación con 6,000 psi para HPLC. En combinación con la preparación de las paredes celulares bacterianas presentadas aquí, los inyectores de muestras de bajo volumen, los detectores con altas tasas de muestreo, volúmenes de muestra más pequeños y tiempos de ejecución más cortos de UPLC permitirán una alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicano y la biología celular bacteriana fundamental en la mayoría de los laboratorios biológicos con acceso a una ultracentrífuga y UPLC.
Introducción
El objetivo del método descrito en este documento es aislar las paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) y digerir el peptidoglicano (PG) de modo que la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) se pueda utilizar para proporcionar información como la identidad de los componentes muropeptide y sus concentraciones, la longitud promedio de las hebras de glicanos y la fracción de material involucrado en los reticulados entre las hebras. Para una discusión detallada de la bioquímica pg y las especies de muropeptide, hay varias revisiones excelentes que describen la estructura pg y su papel en la infección, resistencia, morfogénesis, y el crecimiento1-6....
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Protocolo
1. Cultivar cultivos bacterianos en 2,5 ml de medios durante la noche
Volver a diluir los cultivos 1:100 en 250 ml de medios frescos y crecer a OD600 de 0.7-0.8. Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio al 6% (SDS) en agua.
PRECAUCIÓN: El polvo de SDS es peligroso - evite inhalar el polvo de SDS; use una máscara sobre la nariz y la boca.
2. Día 1 - El desestecimiento de cultivos bacterianos se realiza en el transcurso de un día y durante la noche
- Mientras que los cultivos diludos están creciendo, establezca un baño de agua hirviendo en un plato caliente en un....
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Resultados
Utilizando el procedimiento descrito en la Figura 1,la muestra final debe consistir en al menos 200 μl de solución transparente que se haya filtrado directamente en un vial de UPLC (paso 4.4). La separación uplc de los diversos muropeptides en una muestra bacteriana se basa en su solubilidad relativa entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria de la columna. Las columnas C18 de fase invertida proporcionan una matriz fuertemente hidrofóbica para separar las especies de muropeptide basándose en la h.......
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Discusión
Un paso crítico en este procedimiento es el paso 3.1 del segundo día de preparación de la muestra. Si el SDS se ha precipitado durante la noche, o si las muestras se han almacenado en SDS al 4% durante varias semanas a temperatura ambiente, las muestras deben reboiled durante al menos 1 hora para volver a resolver el SDS. Una causa común de precipitación de SDS es el uso de medios con sales de potasio, por lo que el potasio debe evitarse en los medios si es posible. Como se mencionó en la sección resultados representativ.......
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Divulgaciones
Los costos de producción de este artículo fueron patrocinados por Waters Corporation.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH DP2OD006466 (a K.C.H.). Los autores agradecen a Russell Monds por una demostración práctica del método y por las discusiones científicas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolisina de Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Borohidruro de sodio (NaBH4) | borohidruro de sodio 452882 Sigma-Aldrich es altamente reactivo y peligroso de manejar | ||
| Ácido ortofosfórico | Sigma-Aldrich | 79607 | El ácido ortofosfórico es corrosivo y peligroso de manipular |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | S2002 | La azida sódica es un veneno |
| Tetraborato de sodio | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μ m filtros de jeringa | Fisher | SLGVR04NL | |
| tiras de pH (rango de pH 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polipropileno Tubos Falcon | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm con cuello de rosca vial de recuperación de vidrio | Waters | 186000327C | |
| Dodecil Sulfato de Sodio | Ambion | El polvo AM9820 | SDS es peligroso |
| Instrumentación | |||
| Waters Acquity UPLC Sistema de clase H, que incluye: | |||
| Acquity UPLC Gerente de muestras de clase H FTN | |||
| Acquity UPLC Gerente | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 y micro; m columna | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Colector de Fracciones de Aguas III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Columna Calentador/Enfriador |
Referencias
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Bio....
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Reimpresiones y permisos
