Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.
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Artículo de método
Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen dentro de la división de células en desarrollo Caenorhabditis elegans embriones. En particular, este protocolo se centra en la forma de imagen dividiendo neuroblastos, que se encuentran por debajo de las células de la epidermis y puede ser importante para la morfogénesis epidérmica. La formación de tejidos es crucial para el desarrollo de los metazoos y se basa en las señales externas de los tejidos vecinos. C. elegans es un organismo modelo excelente para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo debido a su transparencia y organización sencilla, haciendo que sus tejidos fácil de estudiar a través de microscopía. Recinto ventral es el proceso donde la superficie ventral del embrión está cubierto por una capa única de células epiteliales. Este evento se piensa que es facilitado por los neuroblastos subyacentes, que proporcionan señales de orientación química para mediar en la migración de las células epiteliales suprayacentes. Sin embargo, los neuroblastos son altamente proliferativa y también pueden actuarcomo un sustrato mecánico para las células epidérmicas ventrales. Los estudios que utilizan este protocolo experimental podrían descubrir la importancia de la comunicación intercelular durante la formación de tejido, y podrían utilizarse para revelar las funciones de los genes implicados en la división celular dentro de los tejidos en desarrollo.
Introducción
Aunque existen protocolos que describen cómo la división celular la imagen a principios del C. elegans embrión, este protocolo se describe cómo la división celular la imagen dentro de un tejido a mediados embriogénesis. Uno de los principales retos en la formación de imágenes organismos durante el desarrollo ha sido su sensibilidad a la fototoxicidad. Sin embargo, el aumento de la accesibilidad a hilar microscopios confocal de disco o microscopios de campo de barrido ha permitido aplicaciones de imagen más extendidos. Ambos sistemas utilizan láseres de estado sólido y la luz difusa, lo que limita los niveles de radiación UV que los organismos están expuestos....
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Protocolo
1. Preparación de las placas para el mantenimiento de cepas de gusanos y escénicas RNAi
- Placas Nematodo Crecimiento Medios
- Placas
- Preparar platos Nematodo Crecimiento Medios (NGM) para mantener cepas de gusanos y realizar cruces genéticos. Combinar 3 g de NaCl, 17 g de agar y 2.5 g de bactopeptona con 1 L de agua destilada en un matraz de 2 L y añadir una barra de agitación de metal.
- Autoclave el matraz para disolver el agar y para esterilizar los medios de comunicación. A continuación, coloque el frasco en una placa de agitación y deje que el material se enfríe mientras se agita.
- Una vez que los medios de comunicación....
- Placas
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Resultados
Este protocolo experimental se describe cómo la división celular en la imagen C. elegans embriones durante mediados de la embriogénesis. En particular, se describe cómo los neuroblastos de la imagen, lo que puede facilitar la morfogénesis epidérmica. Morfogénesis epidérmico se produce debido a una combinación de cambios en la forma de células epidérmicas, la migración y la adhesión, pero también se basa en señales químicas o mecánicas de los neuroblastos subyacentes (Figura 1B). Los neuroblasto.......
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Discusión
Este protocolo describe el uso de diversos tipos de microscopía de divisiones celulares imagen durante mediados embriogénesis. En particular, este protocolo pone de relieve cómo la imagen de la división de los neuroblastos, células que pueden facilitar la morfogénesis epidérmica. La comunicación de célula de la célula es importante para la formación de tejido durante el desarrollo de los metazoos y C. elegans es un modelo excelente para estudiar la formación de tejido in vivo. Un evento que representa .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer que este trabajo recibió el apoyo de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) subvención.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | Para la fabricación de placas de C. elegans NGM y RNAi |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | Para hacer placas de agar LB de bacterias |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anticuerpo anti-ratón Alexa Fluor 488 | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anticuerpo anti-ratón anti-GFP | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-conejo Alexa Fluor 568 | anticuerpo Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Guarde el polvo a 4 & grados; C y ampicilina disuelta a -20 & grados; C |
| Bactopetone (peptona-A) | Bio Básico Inc. | ||
| CaCl2 (cloruro de calcio) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Colesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Disolver en etanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Uso para teñir ácidos nucleicos (ADN) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropiltio-β-galactósido) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Almacene el polvo y el IPTG disuelto a -20 ° C |
| KH2PO4 (fosfato de potasio, monobásico) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (fosfato de potasio, dibásico) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (vector de alimentación) | Addgene | #1654 | Mantener como reserva de glicerol a -80 ° C |
| MgSO4 (sulfato de magnesio) | BioShop Canadá Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (cloruro de sodio) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (fosfato de sodio, dibásico) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Suero de burro normal (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-Propil-3,4,5-trihidroxibenzoato (galato de propilo) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lisina | Sigma-Aldrich | #P8920 | Para obtener resultados óptimos, recubra los portaobjetos del microscopio tres veces |
| Estreptomicina | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Almacene el polvo a 4 & grados; C y estreptomicina disuelta a -20 °C; C |
| Tetraciclina | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Guarde el polvo a 4 & grados; C y tetraciclina disuelta a -20 °C; C |
| Tween-20 | Bio Básico Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Extracto de Levadura | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
Referencias
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-81....
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Reimpresiones y permisos
