Artículo de método

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante C. elegans Embriogénesis

DOI:

10.3791/51188

⸱

12 de marzo de 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Resumen

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Este protocolo describe el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen dentro de la división de células en desarrollo Caenorhabditis elegans embriones. En particular, este protocolo se centra en la forma de imagen dividiendo neuroblastos, que se encuentran por debajo de las células de la epidermis y puede ser importante para la morfogénesis epidérmica. La formación de tejidos es crucial para el desarrollo de los metazoos y se basa en las señales externas de los tejidos vecinos. C. elegans es un organismo modelo excelente para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo debido a su transparencia y organización sencilla, haciendo que sus tejidos fácil de estudiar a través de microscopía. Recinto ventral es el proceso donde la superficie ventral del embrión está cubierto por una capa única de células epiteliales. Este evento se piensa que es facilitado por los neuroblastos subyacentes, que proporcionan señales de orientación química para mediar en la migración de las células epiteliales suprayacentes. Sin embargo, los neuroblastos son altamente proliferativa y también pueden actuarcomo un sustrato mecánico para las células epidérmicas ventrales. Los estudios que utilizan este protocolo experimental podrían descubrir la importancia de la comunicación intercelular durante la formación de tejido, y podrían utilizarse para revelar las funciones de los genes implicados en la división celular dentro de los tejidos en desarrollo.

Introducción

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Aunque existen protocolos que describen cómo la división celular la imagen a principios del C. elegans embrión, este protocolo se describe cómo la división celular la imagen dentro de un tejido a mediados embriogénesis. Uno de los principales retos en la formación de imágenes organismos durante el desarrollo ha sido su sensibilidad a la fototoxicidad. Sin embargo, el aumento de la accesibilidad a hilar microscopios confocal de disco o microscopios de campo de barrido ha permitido aplicaciones de imagen más extendidos. Ambos sistemas utilizan láseres de estado sólido y la luz difusa, lo que limita los niveles de radiación UV que los organismos están expuestos. Sin embargo, puestos de campo amplio todavía se puede utilizar para obtener imágenes in vivo, sobre todo si están equipados con cámaras con alta sensibilidad (por ejemplo EMCCD), control de apertura y control de luz (por ejemplo, LEDs o bombillas de mercurio ajustables). Este protocolo describe cómo utilizar bien un sistema confocal o basado en un sistema de campo amplio para la división celular en el desarrollo de la imagen C. elegans </ Em> embriones. A modo de ejemplo, se describe cómo reproducir la división celular neuroblastos. Los neuroblastos pueden facilitar la morfogénesis epidérmica proporcionando señales químicas o mecánicas a las células de la epidermis suprayacente, y proporcionar un excelente ejemplo de la importancia de la comunicación intercelular en la formación de tejidos.

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ideal para estudios basados ​​en la microscopía, debido a su transparencia y simple organización del tejido 1. Además, C. elegans es susceptible de métodos genéticos y de ARNi, y dado que muchos de sus genes tienen homólogos humanos, puede ser utilizado para identificar los mecanismos conservadas para la formación de tejido 2-5. En C. elegans, la formación de la epidermis ocurre durante la mitad la embriogénesis, cuando el embrión tiene> 300 células. Morfogénesis epidérmico se compone de varias fases principales, durante el cual el embrión está encerrado en una capa de células epidérmicas que constriñen y se extienden para transformar la EMBRyo desde una forma ovoide en la forma alargada de un tornillo sin fin 6. Recinto ventral describe uno de estos eventos morfogenéticos, cuando las células epidérmicas ventrales migran hacia la línea media ventral para cubrir la superficie ventral del embrión (Figura 1). En primer lugar, dos pares de anteriores situada células principales del borde migran hacia la línea media ventral, donde se adhieren y se fusionan con sus vecinos contralaterales 6. Esto es seguido por la migración de las células de bolsillo posterior situado, que forman cuña formas creando un bolsillo ventral 6-7. El mecanismo que cierra el bolsillo no se entiende bien. Una posibilidad es que una estructura contráctil miosina actina supracellular ata las células de bolsillo juntos en un cordón de bolsa como la moda, similar a la cicatrización de la herida 8. Curiosamente, la migración de algunas de las células de bolsillo está mediada por subconjuntos específicos de neuroblastos subyacentes 9 (precursores neuronales que se encuentran debajo de la epidermis; Figura 1B).

Estudios anteriores mostraron que los neuroblastos regulan la migración de las células epidérmicas ventrales y recinto ventral. VAB-1 (receptor de Efrina) y VAB-2 (Efrina ligando) son altamente expresado en los neuroblastos y facilitar la clasificación de los neuroblastos anterior y posterior entre sí, y mutaciones en VAB-1 o VAB-2 causa recinto ventral fenotipos 10-13. Sin embargo, experimentos de rescate promotoras mostraron que también se requiere VAB-1 en las células epidérmicas ventrales suprayacentes y receptores para otras señales de orientación secretadas por los neuroblastos se expresan en las células epidérmicas ventrales 9. Aunque las mutaciones en cualquiera de estos receptores causan fenotipos recinto ventrales, no está claro si surgen defectos debido a problemas en el posicionamiento de los neuroblastos o por insuficiencia de las células epidérmicas ventrales para responder a la orientación Tacos de 14. La alteración de la división de wi neuroblastosthout que afecta su capacidad para secretar señales de orientación podría arrojar luz sobre el papel de los neuroblastos y su capacidad para proporcionar energía mecánica durante la morfogénesis epidérmica. Recientemente, se encontró que un gen de la división celular, ani-1 (anillin) es altamente expresado en los neuroblastos (figura 2A) y su agotamiento causa defectos de división de neuroblastos. Curiosamente, estos embriones exhiben fenotipos recinto ventrales (Fotopoulos, Wernike y Piękny, observaciones no publicadas).

Anillin se requiere para la división celular, y en particular para la citocinesis, que describe el proceso en el que una célula madre divide físicamente en dos células hijas. La citocinesis es impulsado por la formación de un anillo contráctil actomiosina, que debe ser estrechamente controlada en el espacio y el tiempo para asegurarse de que está acoplado correctamente con la segregación de cromátidas hermanas. El regulador maestro de la citocinesis metazoos es RhoA (RHO-1 en C. elegans), una pequeña GTPasa que es unctive en su forma unida a GTP. El FMAM Ect2/ECT-2 activa RhoA, después de lo cual RhoA-GTP interactúa con los efectores que forman el anillo contráctil y median su ingresión 15. Anillin es una proteína de dominio múltiple que se une a RhoA a través de su C-terminal y a la actina y la miosina a través de su extremo N-terminal. Anillin se requiere para estabilizar la posición del anillo contráctil en células de mamífero o de Drosophila S2 16. Agotamiento Anillin causa anillos contráctiles a someterse a oscilaciones laterales, y la citocinesis finalmente falla la formación de células multinucleadas 17-19. Curiosamente, a pesar C. elegans ani-1 coordina la contractilidad actomiosina en el embrión temprano, no es esencial para la citocinesis. Sin embargo, como se describió anteriormente, se requiere ani-1 para la citocinesis neuroblastos durante la mitad de la embriogénesis (Fotopoulos, Wernike y Piękny, observaciones no publicadas). Fracaso Citocinesis alteraría el número y posición de los neuroblastos y podría afectar a la locción de señales de orientación químicos, o podría alterar las propiedades mecánicas del tejido. Ambos modelos destacan el papel no autónoma de neuroblastos de cerramiento ventral, y la importancia de la comunicación de tejidos tejidos durante el desarrollo embrionario.

Este protocolo experimental se describe cómo la división celular imagen durante la C. elegans mediados embriogénesis mediante microscopía de fluorescencia. La mayoría de los experimentos que estudian los mecanismos de la división celular se realizaron en células individuales dentro de placas de cultivo (por ejemplo. HeLa o células S2) o en embriones tempranos con un número limitado de células (por ejemplo, C. elegans embrión de una célula, de Xenopus, o equinodermo embriones). Sin embargo, es importante para estudiar la división celular también dentro de los tejidos, ya que hay señales externas que pueden influir en el tiempo y la colocación del plano de división. Además, las células pueden proporcionar señales químicas o mecánicas para influir en el desarrollo de los tejidos vecinoss, y es importante entender cómo la comunicación intercelular ayuda a los tejidos para formar durante el desarrollo.

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Protocolo

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1. Preparación de las placas para el mantenimiento de cepas de gusanos y escénicas RNAi

  1. Placas Nematodo Crecimiento Medios
    1. Placas
      1. Preparar platos Nematodo Crecimiento Medios (NGM) para mantener cepas de gusanos y realizar cruces genéticos. Combinar 3 g de NaCl, 17 g de agar y 2.5 g de bactopeptona con 1 L de agua destilada en un matraz de 2 L y añadir una barra de agitación de metal.
      2. Autoclave el matraz para disolver el agar y para esterilizar los medios de comunicación. A continuación, coloque el frasco en una placa de agitación y deje que el material se enfríe mientras se agita.
      3. Una vez que los medios de comunicación se ha enfriado y es todavía algo caliente al tacto (45-50 ° C), añadir 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml de solución de 5 mg / ml de colesterol y 25 ml 1 M tampón de fosfato potásico (PPB; receta en la tabla de reactivos / materiales; filtro esterilizar soluciones madre) y verter de inmediato los medios de comunicación en pequeñas cajas de Petri (60 mm x 15 mm; llenar los platos de ~ 4.3 a la parte superior o 13 ml / placa using de un dispensador automatizado). Nota: Para el mantenimiento a largo plazo de algunas cepas de tetraciclina puede ser añadido a las placas (12.5 g / ml) para permitir Tn10 transposón inactivación del gen de la RNasa III bacteriana.
      4. Deje que los medios de comunicación se solidifican durante la noche a temperatura ambiente. Nota: Las placas se deben mantener en una campana biológica o en un área del laboratorio que es menos propenso a la contaminación. También, quite cualquier condensación que se ha acumulado en los párpados (por ejemplo, limpieza con papel de seda) para limitar la contaminación por hongos. Si tetraciclina también se añade a las placas, luego cubrir con papel de aluminio como este antibiótico es sensible a la luz.
      5. Al día siguiente, las semillas NGM placas secas con una suspensión de E. coli (cepa OP50, véase la sección 1.1.2) que ha sido agitaron suavemente. Para hacer placas para el apareamiento, añadir ~ 50 l de OP50 al centro de cada placa (para formar un pequeño círculo). Para hacer placas para mantener cepas de gusano, sembrar cada placa NGM con ~ 100-200 l de OP50 (aasegúrese de que cubre una mayor área de la placa).
      6. Que las placas sembradas O seco / N a temperatura ambiente.
      7. Al día siguiente, vuelta a las placas de NGM secos boca abajo y apilarlos en contenedores de plástico de almacenamiento a 4 ° C. Nota: Las placas son utilizables hasta ~ 3-4 semanas. Las placas que contienen tetraciclina se deben mantener en la oscuridad.
    2. Comida
      1. Utilice E. OP50 coli [Del Caenorhabditis Centro de Genética (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] como fuente de alimento para la C. . elegans Nota: OP50 se puede almacenar como stocks de glicerol a -80 ° C (relación 1:1 en 50% v / v de glicerol).
      2. Para hacer OP50 para las placas de NGM, hacer un plato consecutivas con una pequeña alícuota de la solución madre en glicerol (<10 l, el uso de una punta de pipeta estéril). Separe las bacterias en una placa de agar LB (receta en la tabla de reactivos / materiales) y dejarlo en 37 ° C durante aproximadamente 16 horas. Nota: Si hay problemas con la contaminación, OP50 resistente estreptomicina se puede utilizar, unaND estreptomicina se puede añadir a las placas de agar LB (50 g / ml).
      3. Al día siguiente, elegir una sola colonia e inocular 100 ml de medio LB líquido (receta en la tabla de reactivos / materiales) en un matraz de 500 ml.
      4. Deje que la cultura crezca O / N a 37 ° C con agitación.
      5. Al día siguiente, utilice la suspensión bacteriana para la siembra de NGM placas. Nota: OP50 se puede dividió en alícuotas en tubos de 50 ml cónicos y se almacenó a 4 ° C durante ~ 4-6 semanas.
  2. RNAi
    La alimentación es una de las principales formas de realizar el ARN de interferencia mediada (RNAi; para derribar un producto génico específico) en C. elegans. C. hermafroditas elegans pueden ser alimentados E. coli cepa HT115 transformada con un vector que expresa ARNds de alimentación después de la inducción. Este dsARN (o sus fragmentos) se transmite a la gónada, por lo general resulta en la precipitación sustancial del objetivo gen específico.
    1. Placas de RNAi
      1. Preparar NGM placas como se describió anteriormente (véase la Sección 1.1.1), sino también añadir 1 ml de 1 M de IPTG (isopropiltio-beta-D-galactósido; para inducir la expresión de ARN de doble cadena) y 500 l de 50 mg / ml de ampicilina (Amp; los vectores que expresan dsRNA son Amp -resistente) a los medios de comunicación caliente (45-50 ° C).
      2. Después las placas se han secado, las semillas con ~ 50-100 l de E. coli HT115 (véase la Sección 1.2.2). Nota: las placas no cabeza de serie se pueden almacenar a 4 ° C durante ~ 4-5 semanas.
      3. Deje que las placas sembradas se secan durante la noche a temperatura ambiente.
      4. Al día siguiente, vuelta a las placas de RNAi secos boca abajo y guárdelos en un envase de plástico a 15-20 º C. Nota: placas sembradas conservan eficacia RNAi para un máximo de ~ 2-3 semanas.
    2. RNAi Alimentos
      1. Utilice E. coli HT115 (a partir de la CGC; véase la Sección 1.1.2) transformada con el vector de alimentación L4440, L4440 o que contiene ADNc para un gen de interés. Nota: La alimentación de las bibliotecas que se dirigen a la mayoría de los marcos de lectura abierta en el genomaya se han realizado y se encuentran disponibles (clones en L4440 transformadas en HT115, por ejemplo, que contiene un fragmento de Y49E10.19 para ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / páginas / rnai.html). Nota: HT115 se puede mantener como stocks de glicerol a -80 ° C (relación 1:1 en 50% v / v de glicerol).
      2. Para generar una nueva construcción dirigidas a un gen de interés, ver el mapa vectorial L4440 y cDNA clon entre los promotores T7 que flanquean, que son inducible por IPTG.
      3. Transformar HT115 con el constructo L4440 usando un protocolo estándar para la transformación (por ejemplo, hacer que las bacterias químicamente competentes y realizar la transformación de choque térmico).
      4. Como se describe para OP50 (ver Sección 1.1.2), las bacterias del rayado de la madre de glicerol en una placa de agar LB, pero el plato también debe contener 50 mg / ml de ampicilina. Nota: Si utiliza un pre construcción L4440 existente, omita Secciones 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Elija una sola colonia e inocular 5 mlde medio LB que contiene 5 l de ampicilina de un / ml 50 mg (LB Amp) y colocarlo a 37 ° C con agitación.
      6. Después de aproximadamente 16 horas, inocular 5 ml de medio fresco LB Amp con 50 l de la cultura de O / N y hacer crecer el cultivo durante 7-8 horas con agitación a 37 º C.
      7. Centrifugar las bacterias durante 1 min a 4.000-8.000 x g, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 l de medio fresco LB Amp.
      8. Utilice esta solución bacteriana a sembrar las placas de RNAi como se describe anteriormente (véase el apartado 1.2.1). Nota: HT115 debe utilizarse inmediatamente y no se debe almacenar.

2. El cultivo de cepas de gusano

Mantener C. cepas elegans pedidas a la CGC en placas NGM acuerdo con el protocolo estándar de 1. Las cepas utilizadas para este protocolo son: C. elegans var Bristol, de tipo salvaje (ID deformación a la CGC N2); UNC-119 (tm4063); wgIs102 [ham-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + UNC-119 (+)] (ID deformación a la CGC OP102); UNC-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pastel-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (ID deformación a la CGC OD70); AJM-1 (OK160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (ID deformación a la CGC SU159); UNC-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (ID deformación a la CGC FT250).

  1. Elija ~ 3 adultos hermafroditas jóvenes que muestran el fenotipo correcto a una placa de NGM fresco. Nota: N2 (var. Bristol; de tipo salvaje) se puede mantener entre 15-25 ° C, pero llegará a la densidad más rápido a temperaturas más altas. Se deben hacer nuevas acciones cuando la densidad de gusano es alto.
  2. Mantener todas las cepas fluorescentes (por ejemplo GFP y / o gusanos mCherry-que expresan) a 20-25 ° C para la expresión óptima de proteínas fluorescentes. Se deben hacer nuevas acciones cuando la densidad de gusano es alta y la comida es baja.
  3. Para recoger gusanos, utilice unrecoger a partir de una pipeta de vidrio desmenuzado con un alambre de platino fusionado en el extremo tirado (~ 3-5 cm de longitud). Acoplar el cable con un borde liso. Usar la selección para 'scoop' hasta hermafroditas y transferirlos a nuevas placas. Flamear el cable entre su uso para evitar la contaminación cruzada de las cepas.

3. RNAi

  1. Realización de RNAi
    1. En primer lugar, el lugar ~ 8 hermafroditas L4 en una placa de NGM cabeza de serie para el ~ 30 a 60 min para eliminar las bacterias OP50 de los gusanos.
    2. A continuación, coloque los 8 hermafroditas sobre una placa de NGM Amp IPTG se sembró con HT115 que lleva el plásmido L4440 que expresa ARNds a un gen de interés (por ejemplo, ani-1;. Ver 1.2) durante ~ 24 horas. Nota: En función del gen de interés, o de los fenotipos deseados (que puede depender de la fuerza de la caída), los gusanos se pueden dejar en las placas de RNAi para períodos más cortos o más largos de tiempo (después de las 24 horas, colocar los hermafroditas en RNAi fresca placas).
    3. Para un negControl ativa, colocar gusanos en una placa de RNAi sembraron con HT115 lleva el vector L4440 vacía. Nota: Estos embriones no deben tener fenotipos.
    4. Para un control positivo, colocar gusanos en una placa de ARNi expresar dsRNA que se dirige a un gen con fenotipos bien caracterizados. Nota: Para rho-1 (Y51H4A.3), los embriones son 100% letal después de 24 horas y hermafroditas son estériles después de 48 hr.
  2. Eficacia RNAi
    Los niveles de caída de RNAi se deben probar, sobre todo porque algunos tejidos pueden ser más resistentes que otros. Durante principios de mediados embriogénesis, la mayoría de los tejidos son RNAi y minúsculas, pero a finales del embrión o larva, las neuronas son RNAi resistentes. Las diferentes cepas se pueden utilizar para mejorar la sensibilidad de RNAi (por ejemplo, FRR-3), o para generar ARNi específico de tejido (por ejemplo, SID-1 en combinación con un transgén expresado por el promotor neuronal unc-119).
    1. Western Blotting
      Inmunotransferencia utilizando C. elegans proteínas pueden serrealizado de acuerdo con el protocolo estándar 22.
      1. Después de realizar ARNi, recoger ~ 10 grávido (lleno de embriones) hermafroditas en un tubo de microcentrífuga, añadir 20-30 l 1x tampón de muestra SDS-PAGE y se lisan por ebullición durante ~ 2 min. Del mismo modo, recoger gusanos N2 en un tubo separado para la muestra de control. Nota: El número de hermafroditas puede variar dependiendo de la sensibilidad de los anticuerpos primarios.
      2. Crear diluciones de la muestra de control (por ejemplo, 3-100%) en tampón de muestra. Cargar el control y las muestras de RNAi y ejecutar por SDS-PAGE según el protocolo estándar (el gel% variará dependiendo del tamaño de la proteína de interés).
      3. Transferir el gel a una membrana y realizar inmunotransferencia según el protocolo estándar. Nota: Utilice diferentes diluciones de anticuerpos primarios y secundarios como se recomienda para cada anticuerpo.
      4. Desarrollar (por ejemplo, si se utiliza la quimioluminiscencia) o escanear (por ejemplo, si se utiliza la fluorescencia) el inmunoblot y compara ªe densidad de las bandas en los carriles N2 vs el carril de ARNi, y determinar el nivel de caída (por ejemplo, la densidad de la vía de RNAi coincide con el carril de control de 12%, esto sugiere que la proteína se reduce en un 88%). Nota: Para ver la eficiencia de ANI-1 desmontables, ver Maddox et al 23.
    2. La inmunotinción
      La inmunotinción en C. elegans pueden ser realizados de acuerdo con el protocolo estándar 22.
      1. Después de realizar RNAi, recoger hermafroditas grávidas y embriones de la cosecha utilizando uno de dos métodos. Para uno de los métodos, lugar hermafroditas en tampón M9 (receta en la tabla de reactivos / materiales) en 1,5 ml siliconado tubos de microcentrífuga y pellet por centrifugación (1.000-4.000 xg). Nota: De manera similar recoger N2 hermafroditas grávidas.
      2. Eliminar la solución M9.
      3. Expulsar embriones mediante la adición de 1 ml de solución de blanqueo (1 M de NaOH, 5% de blanqueo) para el tubo de microcentrífuga durante 3 min. Del mismo modo, N2 blanqueador élrmaphrodites hacer diapositivas de control.
      4. Vortex suavemente, luego sedimentar inmediatamente los embriones a través de centrifugación (4.000-8.000 xg) y retire la solución de blanqueo. Nota: El tiempo total que los gusanos se incuban con blanqueador no debe superar los 5 minutos.
      5. Lavar los embriones 3 veces con solución salina amortiguadora Tris (TBS; Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) y de transferencia de embriones utilizando una pipeta Pasteur de vidrio en una poli-L-lisina-revestido portaobjetos de microscopio. Nota: Para recubrir un portaobjetos de vidrio con poli-L-lisina, primero limpie la diapositiva, a continuación, agregar una gota (~ 20 a 30 l) de poli-L-lisina y se extendió uniformemente por toda la superficie y dejar secar. Para obtener resultados óptimos, capa de las diapositivas dos veces más. Un método alternativo para recoger embriones (Secciones 3.2.2.1-3.2.2.5) es colocar una gota de M9 en un poli-L-lisina-revestido portaobjetos de microscopio y recoger ~ 10 hermafroditas grávidas en la gota.
      6. Añadir un cubreobjetos en la parte superior de cada portaobjetos de microscopio (a la zona que contiene la mayoría de los embriones) y lugarlas diapositivas de nitrógeno líquido. Nota: Para los hermafroditas colocados directamente en la gota, ejercer presión sobre el cubreobjetos para romper los hermafroditas y expulsar los embriones.
      7. Freeze-romper los embriones con un movimiento rápido de los cubreobjetos inmediatamente después de la congelación en nitrógeno líquido.
      8. Colocar los portaobjetos en metanol enfriado con hielo durante 20 minutos para fijar los embriones. Nota: Para algunos antígenos, un fijador de reticulación tales como paraformaldehído puede ser preferible. Ver el protocolo de Duerr 22.
      9. Se rehidrata y permeabilizar las embriones por lavado de las diapositivas 4x con solución salina tamponada con Tris que contiene Tween-20 (TBST; Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween-20) durante 10 min cada uno.
      10. Seque cada diapositiva alrededor del área que contiene la mayoría de los embriones y dibujar un círculo alrededor de los embriones con un bolígrafo bloqueo líquido (por ejemplo PAP pluma).
      11. Añadir ~ 100 l de TBST con 5% de suero normal de burro (NDS; bloque) a cada diapositiva (zonas marcadas con círculos) y se incuba durante20 min a temperatura ambiente. Nota: Coloque los portaobjetos en una "cámara húmeda" (por ejemplo, un plato con una tapa que contiene toallas de papel húmedo).
      12. Retire el bloque, agregue ~ 50-100 l de anticuerpos primarios (diluido en TBST) a cada diapositiva (área de un círculo) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Nota: En función del anticuerpo, la dilución y tiempo de incubación puede variar. Para detectar GFP, utilizamos un anti-ratón anti-GFP anticuerpo primario en una dilución de 1/200. Para detectar ANI-1, se utiliza un anti-conejo anti-ANI-1 anticuerpo primario en una dilución 1/1600 (amablemente proporcionados por Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Para tiempos de incubación más largos, coloque las diapositivas a 4 ° C.
      13. Retire anticuerpos primarios (si es posible, mantener para uso futuro) y lavar los portaobjetos 3x con TBS durante 5 minutos cada uno.
      14. Retire el último lavado y añadir ~ 50-100 l de anticuerpos secundarios (diluido en TBST) a cada diapositiva (zonas marcadas con círculos) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Nota: En función del anticuerpo, la dilución puede variar. Para detectar GFP, utilizamos un unanti-ratón Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario en una dilución de 1/250. Para detectar ANI-1, se utiliza un anti-conejo Alexa Fluor 568 anticuerpo secundario en una dilución de 1/250.
      15. Eliminar anticuerpos secundarios y lavar 3 veces con TBS diapositivas durante 5 min cada uno. Nota: Para la tinción de ADN, añadir ~ 50-100 l de DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol; 1 mg / ml) a 1/500 de dilución en TBST durante 5 min.
      16. Retire DAPI y lavar los portaobjetos 2 veces con TBS durante 5 minutos cada uno. Nota: Si no se realiza la tinción DAPI, omita este paso de lavado extra.
      17. Realice un lavado rápido con 0,1 M Tris (pH 9), quitar y añadir ~ 15 l de medio de montaje precalentado a 37 º C (4% de n-propilo 3.4.5-trihydroxybenzoate (galato de propilo), 50 mM Tris, pH 9 en 50% de glicerol) para cada diapositiva (área de un círculo).
      18. Añadir un cubre a cada diapositiva (en la parte superior de los medios de montaje en el área de un círculo), absorber el exceso de líquido y sellar las diapositivas con esmalte de uñas. Nota: Las diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C.
      19. Observe los embriones enlas diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio o escaneo láser confocal microscopio. Es importante destacar que ajustar la configuración para recoger imágenes de la intensidad óptima de píxeles con el control de los embriones (N2 o no RNAi). Luego, recoger imágenes a partir de embriones de RNAi con los mismos valores. Los ejemplos de las imágenes recogidas por el control vs ani-1 RNAi embriones se muestran en la Figura 2B.

4. Preparación de las diapositivas de imágenes en vivo y Cosecha embriones

  1. Preparación de pastillas de agarosa para formación de imágenes en vivo
    1. Coloque un recipiente limpio, pre portaobjetos calentado entre dos diapositivas, cada una con 1-2 tiras de cinta sobre ellos.
    2. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, añadir una gota de 2% w / v de agarosa (disuelto en agua destilada calentada) a la diapositiva.
    3. Coloque rápidamente una segunda, portaobjetos limpio en la parte superior de la primera diapositiva de una manera perpendicular a aplanar la gota de agarosa. Nota: La cinta en la vecina deslizóes proporciona el espesor de la almohadilla.
    4. Deje que la agarosa seca pad para un 1-2 minutos antes de retirar el carro superior. Deslice el carro superior con cuidado para evitar romper la almohadilla de agarosa debajo. Nota: A veces la almohadilla se transfiere a la corredera superior y es aún utilizable, siempre y cuando se mantenga intacta.
    5. La transferencia de los embriones en la almohadilla de agarosa dentro de unos pocos minutos después de su preparación como se describe a continuación (véase el paso 4.2). Nota: La plataforma debe tener un aspecto opaco, una vez que está claro, es demasiado seco para su uso.
  2. Embriones de cosecha
    1. Utilice el siguiente protocolo para la recogida de embriones de imágenes en vivo, que se deriva de Sulston et al. 24
    2. Elige aproximadamente 4-6 adultos grávidas (no hambre) a partir de placas de NGM o RNAi y colocarlos en 20-30 l de tampón M9 en un pozo en un portaobjetos de la depresión.
    3. Utilice un bisturí esterilizado para cortar los gusanos a cada lado de la espermateca (o, alternativamente, cerca de la vulva) aliberar los embriones en la solución.
    4. Utilice una manguera de goma con una boquilla conectada a un capilar de vidrio / pipeta tirado a tener un pequeño agujero y succionar los embriones por pipetear con la boca. Alternativamente, recoger los embriones con un tubo de vidrio capilar que está conectado a una pera de goma pipeta Pasteur.
    5. La transferencia de los embriones succionadas a un segundo pozo también contiene tampón M9, para ayudar a separarlos de los escombros gusano.
    6. Entonces, la succión de los embriones en una almohadilla de agarosa recién preparado (véase el paso 4.1).
    7. Los embriones se agrupan utilizando una pestaña (pegado a un palillo de dientes) para aumentar el número de embriones que pueden ser filmados en uno plano x, y. Nota: Para evitar la falta de oxígeno, no agrupan más de 10 embriones juntos.
    8. A continuación, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos y parcialmente sellarlo con pre valap líquido calentado (vaselina, lanolina y parafina; derretido y 01:01:01 combinado) para prevenir la deshidratación de los embriones durante la exploración. Nota: Adicional M9 buffer can ser añadido a la almohadilla para asegurar que los embriones tienen suficiente líquido para formación de imágenes. En lugar de valap, vaselina se puede utilizar para sellar parcialmente cubreobjetos, pero es menos rígido que causan los cubreobjetos se deslicen y se podrían obtener en los objetivos de microscopio.

5. Imágenes en vivo

  1. Para visualizar los neuroblastos, obtener una cepa gusano que expresa una proteína-neuroblast específica unida a una proteína fluorescente (por ejemplo, HAM-1: GFP, ID deformación a la CGC OP102). Para detectar las membranas celulares, utilizar una cepa de gusano que también expresa un dominio de proteína que reconoce lípidos unidos a una proteína fluorescente diferente (por ejemplo, mCherry:. PH, Identificación deformación a CGC OD70).
  2. Embriones Cosecha de hermafroditas fluorescentes mantienen en control o ani-1 RNAi placas (ver Protocolos 3 y 4), y preparar las diapositivas como se describió anteriormente (véase el Protocolo 4).
  3. Embriones de la imagen en 4D (x, y, z y time-lapse) por microscopía de epifluorescencia. Utilice una wisistema defield [microscopio de fluorescencia automatizado con filtros para GFP y TexasRed, objetivos de hasta 60X o 100X, una alta resolución CCD (dispositivo de carga acoplada) de la cámara, altamente motorizados etapa (por ejemplo. Piezo Z) y un software especializado adquisición] campo o una livescan barrieron microscopio confocal [automatizado de barrido microscopio fluorescente con 488 nm y 561 nm láseres, los objetivos hasta 100X, un EMCCD (electrones multiplicando CCD) de la cámara, altamente motorizado etapa (por ejemplo Piezo Z) y un software especializado adquisición]. Nota: Para que el sistema de campo amplio, utilizando los LED y una cámara EMCCD limitará fototoxicidad. También, un microscopio confocal de disco giratorio se puede utilizar en lugar del sistema de campo de barrido.
  4. Para la división celular imagen neuroblastos en uno u otro sistema, encontrar x, marcos xey de embriones utilizando los 10X o 20X objetivos y elija una x óptimas, marco y donde los embriones están experimentando intercalación dorsal (paso antes de su cierre ventral; Figura 1A) o son en las primeras etapasde recinto ventral (~ 350 min después de la primera división celular; Figura 1A).
  5. En el microscopio de campo barrido, utilizar el 488 nm y 561 nm lasers 100 MW a la potencia del 40%, con una hendidura de 50. En el sistema de campo amplio, utilice los filtros de las buenas prácticas agrarias y TexasRed con intensidad de la luz de baja-media (si es regulable). Nota: Para que el sistema de campo amplio, los LED tienen una baja fototoxicidad y son preferibles.
  6. En cualquiera de los sistemas, utilizar los objetivos de inmersión en aceite 60X o 100X y recoger 20 Z-pilas de 0,2 m cada 2 min durante un total de 10 min. Nota: Aunque la HAM-1: GFP y mCherry: sondas de pH expresan en niveles relativamente altos, los tiempos de exposición para cada sonda tendrá que ser optimizado para diferentes microscopios. Nota: Para que el sistema de campo amplio, se recomiendan menos Z-pilas para limitar la fototoxicidad y para obtener imágenes durante períodos más largos de tiempo, utilizan menos los puntos de tiempo.
  7. Para reducir al mínimo la fototoxicidad causada por la exposición de los embriones a la luz UV en el sistema de campo amplio (si se utiliza un mercbombilla ury), cerrar la abertura y el 30% y disminuir la intensidad de la luz (utilizando un sistema de iluminación ajustable). Nota: Aunque el aumento no es necesario el uso de uno u otro sistema, otros microscopios pueden tener fuentes de luz con menor intensidad u objetivos con diferentes aperturas numéricas, lo que podría requerir el uso de ganancia para obtener imágenes de una intensidad óptima de píxeles. Prueba de las condiciones utilizando un embrión de control para asegurarse de que cualquier fenotipos observados no se deben a la fototoxicidad artefactos.

6. Análisis de Microscopía de datos

  1. Para el análisis de las imágenes, archivos de exportación como archivos TIFF y abrir los archivos TIFF como una pila utilizando software especializado, como un programa de procesamiento de imágenes basado en Java (por ejemplo, ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nota: Dependiendo del software de adquisición utilizado para recoger las imágenes, los archivos se pueden guardar en su forma original y se abrieron en ImageJ. Esto es preferible como los metadatos se mantiene con los archivos.
  2. Separe la pilaen "imágenes" y los puntos de selección de tiempo y Z-planos si lo deseas. Nota: A pesar de que se adopte una pila de 20 Z-planos, muchos de los neuroblastos son <1 m de espesor durante la mitad de la embriogénesis tardía y sólo se necesitan unos pocos Z-planos.
  3. Vuelva a apilar los planos Z seleccionados para cada momento y hacer proyecciones Z-stack separadas. A continuación, se apilan las proyecciones para cada punto juntos para hacer una secuencia de tiempo.
  4. Realizar ajustes en el brillo / contraste y o para cada canal.
  5. A continuación, seleccione una región de interés, los cultivos (y girar si es necesario) de la región.
  6. Crear imágenes fusionadas mediante la función de los "canales fusionadas y elegir un color diferente para cada canal. Convertir imágenes fusionadas a RGB.
  7. Invierta las imágenes en escala de grises para cada canal de los pasos 6.3 o 6.4 (uso de la función 'invertido' en 'edit') para visualizar las imágenes con mayor claridad.
  8. Guarde todas las imágenes finales como archivos TIFF de 8 bits para hacer figuras en el vector basado softwson programas o como archivos de QuickTime para hacer películas.
  9. Si se necesitan mediciones de tamaño de píxel (por ejemplo, para incluir una barra de escala con las imágenes), utilizar ImageJ, u otro software de procesamiento de imagen para medir el tamaño del embrión. Nota: Las imágenes recogidas utilizando diferentes objetivos tienen diferentes tamaños de píxeles.

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Resultados

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Este protocolo experimental se describe cómo la división celular en la imagen C. elegans embriones durante mediados de la embriogénesis. En particular, se describe cómo los neuroblastos de la imagen, lo que puede facilitar la morfogénesis epidérmica. Morfogénesis epidérmico se produce debido a una combinación de cambios en la forma de células epidérmicas, la migración y la adhesión, pero también se basa en señales químicas o mecánicas de los neuroblastos subyacentes (Figura 1B). Los neuroblasto...

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Discusión

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Este protocolo describe el uso de diversos tipos de microscopía de divisiones celulares imagen durante mediados embriogénesis. En particular, este protocolo pone de relieve cómo la imagen de la división de los neuroblastos, células que pueden facilitar la morfogénesis epidérmica. La comunicación de célula de la célula es importante para la formación de tejido durante el desarrollo de los metazoos y C. elegans es un modelo excelente para estudiar la formación de tejido in vivo. Un evento que representa ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean reconocer que este trabajo recibió el apoyo de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) subvención.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarBioShop Canada Inc.#AGR001.1Para la fabricación de placas de C. elegans NGM y RNAi
AgarBio Basic Inc.#9002-18-0Para hacer placas de agar LB de bacterias
AgaroseBioShop Canada Inc.#AGA001.500
Anticuerpo anti-ratón Alexa Fluor 488Life Technologies Corporation (Invitrogen)#A11029
Anticuerpo anti-ratón anti-GFPRoche Applied Science#11814460001
Anti-conejo Alexa Fluor 568anticuerpo Life Technologies Corporation (Invitrogen)#A11011
AmpicillinBioShop Canada Inc.#AMP201.5Guarde el polvo a 4 & grados; C y ampicilina disuelta a -20 & grados; C
Bactopetone  (peptona-A)Bio Básico Inc.
CaCl2 (cloruro de calcio)BioShop Canada Inc.#C302.1
ColesterolBioShop Canada Inc.#CHL380.25Disolver en etanol
DAPI Sigma-Aldrich#D9542Uso para teñir ácidos nucleicos (ADN)
GlycerolBioShop Canada Inc.#GLY001.1
IPTG (isopropiltio-β-galactósido)Bio Basic Inc.#367-93-1Almacene el polvo y el IPTG disuelto a -20 ° C
KH2PO4 (fosfato de potasio, monobásico)BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4 (fosfato de potasio, dibásico)BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440  (vector de alimentación)Addgene#1654Mantener como reserva de glicerol a -80 ° C
MgSO4    (sulfato de magnesio)BioShop Canadá Inc.#MAG511.500
NaCl (cloruro de sodio)Bio Basic Inc.#7647-14-5
Na2HPO4 (fosfato de sodio, dibásico)Bio Basic Inc.#7558-79-4
Suero de burro normal (NDS)Wisent Bioproducts#035-110
n-Propil-3,4,5-trihidroxibenzoato (galato de propilo)Alfa Aesar#A10877
Poly-L-lisinaSigma-Aldrich#P8920Para obtener resultados óptimos, recubra los portaobjetos del microscopio tres veces 
EstreptomicinaBioShop Canada Inc.#STP101.50Almacene el polvo a 4 & grados; C y estreptomicina disuelta a -20 °C; C
TetraciclinaBioShop Canada Inc.#TET701.10Guarde el polvo a 4 & grados; C y tetraciclina disuelta a -20 °C; C
Tween-20Bio Básico Inc.CAS#9005-64-5
TryptoneBioShop Canada Inc.#TRP402.500
Extracto de LevaduraBio Basic Inc.#8013-01-2
#G213

Referencias

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