Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

Resumen

Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.

Resumen

Este protocolo detalla un método para analizar la capacidad de progenitores hematopoyéticos purificados para generar células dendríticas plasmacitoides (PDC) en el parche de Peyer del intestino (PP). Progenitores de células dendríticas comunes (LDC, lin ^- c-kit ^Lo CD115 ⁺ de Flt3 ⁺⁾ se purificaron a partir de la médula ósea de ratones C57BL6 por FACS y se transfirieron a ratones receptores que carecen de una población significativa PDC en PP, en este caso, IFNAR ^{- / -} los ratones se usaron como los destinatarios de transferencia. En algunos ratones, la sobreexpresión del ligando de Flt3 factor de crecimiento de células dendríticas (Flt3L) se aplica antes de la transferencia adoptiva de los CDP, usando la transferencia de genes hidrodinámico (HGT) de plásmido Flt3L-codificación. Flt3L sobreexpresión expande poblaciones de DC procedentes de transferidos (o endógenos) progenitores hematopoyéticos. A los 7-10 días después de la transferencia progenitor, PDC que surgen de los progenitores de forma adoptiva transferidos se distinguen de las células receptoras de labase de la expresión del marcador CD45, con PDC de los CDP transferidos siendo CD45.1 ⁺ y ser receptores CD45.2 ^+. La capacidad de los CDP transferidos a contribuir a la población PDC en PP y para responder a Flt3L se evaluó por citometría de flujo de PP suspensiones de células individuales de los ratones receptores. Este método puede ser usado para probar si otras poblaciones progenitoras son capaces de generar PP PDC. Además, este enfoque podría utilizarse para examinar el papel de los factores que se predice que afectan el desarrollo PDC en PP, mediante la transferencia de subconjuntos progenitoras con una caída apropiada, nocaut o sobreexpresión del factor de desarrollo putativo y / o mediante la manipulación de citocinas circulantes a través de HGT . Este método también puede permitir el análisis de cómo PDC PP afectan a la frecuencia o la función de otros subconjuntos inmunes en PP. Una característica única de este método es el uso de IFNAR ^{- / -} ratones, que muestran severamente reducida PP PDC en relación con los animales de tipo salvaje, por lo tanto allowing reconstitución de PP PDC en la ausencia de efectos de confusión de la irradiación letal.

Introducción

Este sentido, demuestran un protocolo para evaluar si progenitores de células dendríticas comunes (LDC) son capaces de dar lugar a la célula dendrítica plasmocitoide población (PDC) en las placas de Peyer (PP). El objetivo general de la utilización de este método fue el de evaluar la regulación del desarrollo del PDC en las placas de Peyer (PP PDC). La razón de que esto es importante es que PDC PP difieren de PDC se encuentran en otros tejidos, incluyendo la médula ósea, la sangre y el bazo, y por lo tanto no está claro si PDC PP y otras poblaciones PDC son de desarrollo y / o funcionalmente relacionadas. Específicamente, PDC son ampliamente conocidos por ser el principal tipo I de interferón (IFN) productores en el sistema hematopoyético, en respuesta a Toll-like receptor 7 y 9 (TLR7 / 9) la estimulación de la secreción de IFN rápido ^1-3. Sin embargo, PDC PP son deficientes en la producción de IFN de tipo I en respuesta a la estimulación de TLR agonista ^4,5. Por otra parte, PP PDC también difieren de PDC que se encuentran en la médula ósea y el bazo enque requiere señales del interferón de tipo I (IFN) receptor (IFNAR1) o la señalización de IFN STAT1 molécula para su desarrollo y / o acumulación ^5. Estos datos han sugerido la posibilidad de que distintos mecanismos de regulación controlan PDC PP frente a PDC en otros órganos (por ejemplo, médula ósea, bazo) ^5.

La razón que llevó al desarrollo de este método se basa en los últimos avances en la comprensión de células dendríticas (DC) la biología. La mayoría, si no todos, los subconjuntos de DC se derivan de progenitores hematopoyéticos que expresan el receptor de tirosina quinasa 3 similar al FMS (de Flt3) ^6-10; sin embargo, el desarrollo de CC no está restringido a la mieloide clásico y vías linfoides. Por ejemplo, Flt3 ⁺ progenitores mieloides comunes (CMPS, lin ^- IL-7R ^- Sca-1 ^- c-kit ⁺ CD34 ⁺ FcγR ^{más altas / -)} dan lugar a los CDP (lin ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ FIt3 ^+), which diferenciar aún más en los países en desarrollo y PDC convencionales (CDC) ^{de 9,10.} Por el contrario, de Flt3 ⁺ progenitores linfoides comunes (CLPS, lin ^- IL-7R ⁺ Sca-1 ^lo c-kit ^lo) se desarrollan principalmente en PDC ^11. Por lo tanto, los estudios anteriores indican PDC surgen de, al menos, 2 poblaciones progenitoras hematopoyéticas distintas en el marco de la regulación de Flt3L, aunque el análisis típico se ha limitado a la médula ósea, el bazo y / o subconjuntos PDC sangre. Por lo tanto, la población (s) progenitor que genera PP PDC requiere investigación. La comprensión de los orígenes del PP PDC arrojará luz sobre si comparten vías de desarrollo comunes con otras poblaciones PDC, o utilizar mecanismos distintos durante su generación en el PP.

Una ventaja única del enfoque descrito en el presente documento es el uso de ratones que muestran una deficiencia grave en PP PDC como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas. Los ratones con el gensupresión de tic en el gen que codifica IFNAR1 (IFNAR ^{- / -} ratones) o STAT1 (Stat1 ^{- / -)} reveló un agotamiento sorprendente en PP PDC ^5. Por lo tanto, estas cepas proporcionan un entorno en el cual se reducen PDC PP, lo que permite estudios de transferencia adoptiva que se realizaron en ausencia de los regímenes de ablación celular potentes tales como la irradiación letal. Una fuerza adicional del método presentado aquí es el uso de la transferencia génica hidrodinámica (HGT) para estimular cantidades circulantes elevados de Flt3L. Esto proporciona un enfoque rentable para inducir Flt3L in vivo, en comparación con la inyección de la proteína recombinante. Numerosos estudios, incluyendo aquellos en nuestro laboratorio, han empleado HGT para inducir cantidades de citoquinas en una variedad de condiciones experimentales ^5,12,13.

La división del trabajo y las funciones inmunológicas precisas para los países en desarrollo es de gran interés en la inmunología. En particular, el PDC son importantes mediadores de la tolerancia oral y anti-viral sistémicarespuestas, sin embargo, también parecen contribuir al desarrollo y persistencia de la autoinmunidad y el cáncer de ^14-17. El protocolo se describe en este documento permitirá a los mecanismos de desarrollo que regulan PP PDC para ser más plenamente exploradas. Además, este enfoque puede permitir que los estudios para evaluar la función PP pDC, y puede ser extendida a la comprensión de la regulación y la función de otras poblaciones inmunes dentro de los PP.

Protocolo

Aprobación institucional se debe obtener por adelantado para todas las manipulaciones experimentales descritas en el presente documento con ratones. Estos incluyen el uso de ratones C57BL6 para el aislamiento de células progenitoras de médula ósea, IFNAR ^{- / -} ratones como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas y el uso de HGT para la sobreexpresión de citoquinas in vivo. Alojamiento adecuado y cuidado de los animales también deben ser proporcionados por el investigador o institución. Además, la aprobación institucional puede ser necesaria para los plásmidos utilizados en la transferencia de genes hidrodinámico (es decir, la aprobación de ADN recombinante). Los estudios aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso del Centro de Cáncer MD Anderson de la UT.

1. Transferencia génica hidrodinámica (HGT)

Este paso debe ser realizado 2 días antes de la transferencia adoptiva de los CDP para inducir circulantes Flt3L para la expansión de DC in vivo ^5. Prepare al menos 5 destinatario ratones / grupo.

1. Para lograr eficiente HGT, los vasos sanguíneos del receptor IFNAR ^{- / -} ratones (CD45.2 ⁺⁾ deben ser dilatados mediante la exposición de los ratones a una lámpara de calentamiento durante 5-10 min.
2. Coloque el ratón en un dispositivo de inmovilización y desinfectar su cola con etanol al 70%.
3. Inyectar 5 g de plásmido que codifica Flt3L en 2 ml de PBS estéril en la vena de la cola usando una aguja de calibre 27. Para la cohorte de control, inyección de 5 mg de vector vacío (pORF) a través de la vena de la cola como se indica.
4. Monitorear los ratones durante 15-30 minutos para asegurar que no hay efectos nocivos de la inyección en la vena de la cola. Ratones Volver a instalación de vivienda durante 2 días.

2. Aislamiento de Progenitores Hematopoyéticas de médula ósea de ratón

Este paso se debe realizar 2 días después de HGT. Utilice CD45.1 ⁺ ratones congenic como la fuente de progenitores de la médula ósea para la transferencia adoptiva en receptor IFNAR ^{- /}- animales (CD45.2 ^+). En este protocolo, se requieren cepas congenic para distinguir donante y el receptor DCs derivadas, así como para evitar el agotamiento inmune mediada por MHC de falta de coincidencia. Se requieren aproximadamente 10 a 20 ratones para proporcionar un número suficiente de células progenitoras hematopoyéticas (10 ⁵ células / ratón receptor) para los experimentos de transferencia.

1. La eutanasia a 10 congenic CD45.1 ⁺ ratones mediante asfixia con _CO2 y dislocación cervical.
2. Coloque cada canal en una bandeja de disección y esterilizar el abdomen y las piernas con etanol al 70%.
3. Hacer una incisión en la mitad del abdomen y cortar a través de la piel del abdomen para cada pierna, corte de la piel a lo largo de la pierna.
4. Retire con cuidado la piel de cada pierna, y cortar y quitar las patas de la canal por la articulación de la cadera con unas tijeras afiladas.
5. Retire con cuidado los músculos del fémur y la tibia de cada pata usando una cuchilla afilada.
6. Eliminarambos extremos del fémur y la tibia con un escalpelo afilado y lugar los huesos en una placa de cultivo que contiene RPMI completo (RPMI con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino, 1% penicilina / estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y 50 mM β-mercaptoetanol) .
7. Preparar una jeringa que contiene 1 ml de RPMI completo, conectados a una aguja 27.
8. Insertar la aguja de 27 G en un extremo del fémur o de la tibia. Enjuague la médula ósea del fémur o de la tibia mediante la inyección suavemente el RPMI completo en el hueso. Asegúrese de que las células de médula ósea están siendo removidos del hueso, lo que puede lograrse mediante la detección visual de medios expulsados ​​que parece nublada.
9. Repita el lavado cada fémur y la tibia 3x para eliminar completamente las células de la médula ósea.
10. Preparar una suspensión de células pipeteando suavemente las células hacia arriba y abajo de 3 a 5 veces en la placa de cultivo.
11. Retire los residuos haciendo pasar las células de la médula ósea a través de un colador de 40 células M, la colocación de las células de exudados en una nueva culturalmentee plato. Interrumpir cualquier grupos de células que aparecen en el colador por una suave presión con el extremo de un émbolo de jeringa estéril.
12. Lisar las células rojas de la sangre (RBC) presentes en la suspensión de células de médula ósea total de con tampón de lisis RBC comercial según las instrucciones del fabricante. Utilice 2 ml RBC lisis buffer/4-6 x 10 ⁷ células (generalmente células de un ratón) y un tiempo de incubación de 5 min a temperatura ambiente.
13. Lavar las células de la médula ósea por la granulación células por centrifugación durante 4 min a 500 xg, aspirando suavemente el medio de cultivo, resuspender en 10 ml de tampón FACS (PBS 1x + 2 mM de EDTA + 1% de FBS), células de revestimiento por centrifugación y suavemente aspirando de lavado tampón.
14. Repetir el lavado, como se describe en el paso 2,13, para un total de 2 lavados.

3. Fluorescencia de células activadas (FACS) para aislar los CDP

Este paso requiere el acceso a un separador de células MidiMACS y columnas MACS LD para un procedimiento de selección negativa inicial,así como una máquina de FACS con al menos 3 láseres para purificar el subconjunto progenitoras multicolor después de la tinción con anticuerpos conjugados con fluorescencia.

1. Después del segundo lavado en el paso 2.14, contar las células de la médula ósea. Sedimentar las células por centrifugación como se describe en el paso 2.13 y resuspender en tampón FACS para lograr una concentración final de 4 x 10 ⁷ células por 30 l de tampón FACS.
2. Para preparar las células para FACS, las células de linaje negativo primero se enriquecen con una técnica de selección negativa que elimina las células de linaje positivo de la mezcla de médula ósea usando cromatografía en columna de esferas magnéticas. Para el procedimiento de selección negativa, se añade 1 g de cada uno de los siguientes anticuerpos anti-ratón de rata comercial (ABS) que reconocen marcadores de linaje hematopoyético: CD3, CD19, CD11c, CD11b y Ter-119 Abs. Los Abs debe añadirse en un volumen de 2 l / Ab a la suspensión de células 30 l en tampón de FACS.
3. Se incuba la suspensión celular a 4 º C durante 30min. Después de la incubación, se lavan las células dos veces con 10 ml de tampón FACS como se describe en el paso 2,13.
4. Resuspender las células para alcanzar una concentración final de 4 x 10 ⁷ cells/40 l de tampón FACS. Añadir 20 l de cabra anti-rata microperlas magnéticas IgG por cada 40 l de suspensión celular. Mezclar suavemente y se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar las células con 10 ml de tampón FACS como se describe en el paso 2,13.
5. Resuspender hasta 10 células de la médula ósea ⁸ en 500 l de tampón FACS.
6. Cargar una columna MACS LD en un separador de células MidiMACS según las instrucciones del fabricante y pre-enjuague de la columna con tampón de 2 ml de FACS.
7. Aplicar la suspensión de células de médula ósea de la columna, la carga de hasta 5 x 10 ⁸ células en 2,5 ml de tampón FACS. Asegurar un tubo de recogida (tubo cónico de 15 ml) se coloca debajo de la columna. Lavar la columna 3 veces con 2 ml de tampón FACS / lavado, y recoger las células que pasan a través de la columna, que se enriquece paracélulas de linaje negativo. Contar las células en el material eluido (WASH-a través) de la columna.
8. Para llevar a cabo la selección positiva de subconjuntos progenitoras hematopoyéticas por FACS, las células de tinción con la siguiente Abs conjugado con fluorescencia: IL-7R (Pacific Blue), de Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, además de una mezcla de Abs marcadores de linaje dirigidos contra CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 y Ter119 (todo marcado con PerCP Cy5.5). Utilice 0,5-1 l de cada Ab en un volumen total de 100 l. Incubar suspensión de células a 4 º C durante 20-30 min.
9. Lavar las células como se indica en el paso 2.13 y resuspender en tampón de FACS en una concentración de 2-3 x 10 ⁷ células / ml. Filtrar células a través de un tubo 35 M tapa filtro de células para eliminar los agregados celulares. Este último paso es crucial para evitar la obstrucción de la máquina FACS.
10. Coloque la suspensión de células en un tubo de FACS en el escenario FACS y ordenar los CDP (lin ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ FIt3 ⁺⁾ en elbase del perfil de marcador indicado. Recoger las células purificadas en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de RPMI completo.
11. Registre el número absoluto de células clasificadas al final de la carrera FACS. Sedimentar las células por centrifugación como se indica en el paso 2.13 y resuspender en PBS estéril para experimentos de transferencia adoptiva.

4. La transferencia adoptiva de los CDP

Este paso se realiza por lo general en las instalaciones de animales, donde se alojan los ratones receptores. Dependiendo de la ubicación de la máquina de FACS, que puede implicar el transporte de las poblaciones de células progenitoras purificadas en las instalaciones de animales antes de la transferencia adoptiva. Suspensiones de células progenitoras deben mantenerse estéril y transportados en hielo.

1. Preparar suspensiones de células para la inyección mediante la dilución de 10 ⁵ CDP purificados en un volumen total de 100 l de PBS estéril. Coloque suspensión de células en una jeringa conectada a una aguja de calibre 27.
2. Exponer el receptor IFNAR ^{- / -} ratones (CD45.2 ⁺⁾ a una lámpara de calentamiento durante 5-10 minutos para conseguir la inyección eficiente a través de la vena de la cola.
3. Coloque el ratón en un dispositivo de inmovilización y desinfectar su cola con etanol al 70%.
4. Inyectar 10 CDP ⁵ FACS-purificado en 100 l de PBS en la cola vena con una aguja de 27.
5. Monitorear los ratones durante 15-30 minutos para asegurar que no hay efectos nocivos de la inyección en la vena de la cola. Ratones Regreso a las instalaciones de la vivienda.

5. El aislamiento del PP y Medición de pDC Cantidades

1. A los 7-10 días después de la transferencia adoptiva, la eutanasia a los ratones receptores. Abra suavemente el ratón por la disección y exponer el intestino.
2. Quite todo el intestino y colocarlo en toallas de papel empapadas-PBS. Recoge todos los PPs visibles a lo largo de la pared del intestino delgado mediante finas pinzas y tijeras. C57BL6 y IFNAR ^{- / -} ratones tienen típicamente 5-10 PP / ratón, que son diferentes de los folículos linfoides aislados encontradosa lo largo del intestino delgado ^18. Tenga en cuenta que los PPs suelen ser estructuralmente distintos, incluso dentro de un solo ratón, asegúrese tan cuidadosamente todos los PPs se identifican y disecados.
3. Coloque PP en una placa de Petri que contenía PBS, y el uso de fórceps para eliminar las heces. Repita este procedimiento dos veces para limpiar los PP.
4. Resumen PP con 1 mg / ml de colagenasa IV en 10 ml de solución salina equilibrada de Hank 1x (HBSS) en un matraz de 50 ml con agitación vigorosa durante 1 hora a 37 ° C.
5. Coloque el PP digerido en el compartimiento superior de un 40 micras células colador celular y de la fuerza a través del filtro con un émbolo de jeringa estéril. Recoger la suspensión de células PP en un tubo cónico de 15 ml.
6. Pellet células PP tensas por centrifugación a 500 xg durante 5 min y se vuelve a suspender en 6 ml de solución de Percoll 37% (37% de Percoll en medio RPMI). Colocar suavemente 6 ml de solución de Percoll 70% (70% de Percoll en medio RPMI) por debajo de la suspensión de células, para formar un paso de gradiente de Percoll.
7. Centrifugar las células durante 20 min unaT 800 xg con la centrífuga rompa. Las células mononucleares se migrar a la interfaz 37/70%. Después de la centrifugación, la población de células mononucleares se debe recoger por cuidado de pipeteado en la región de interfaz. Pellet recogió células por centrifugación y se lavan dos veces en 50 ml de RPMI completo / lavado. Un gran volumen se utiliza para asegurar la eliminación completa de Percoll.
8. Teñir las células PP recolectados con los siguientes anticuerpos para detectar PDC murinos que se derivan de los progenitores de forma adoptiva transferidos (CD45.1 ⁺⁾ o ratones receptores (CD45.2 ^+): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) y PDCA-1 (FITC) Abs. Realizar análisis de citometría de flujo de células PP como se indica en los pasos 3.9 y 3.10. Identificar PDC por su CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ⁺ Siglec-H ⁺ PDCA-1 ⁺ fenotipo. Números absolutos PDC se pueden determinar por la siguiente ecuación:% PDC x parael número de células tal PP = PP PDC.

Resultados

Nuestros resultados muestran la estrategia de activación periódica para el aislamiento de los CDP a partir de células de médula ósea de ratón (Figura 1), como se detalla en los Protocolos 2 y 3. CDP comprenden aproximadamente el 0,1% del total de células de la médula ósea, y aproximadamente 4-6 x 10 ⁴ CDP pueden ser aislados de un ratón. Tras la transferencia adoptiva, CDP se diferencian en PDC y CDC ^10.

Discusión

La técnica de transferencia adoptiva descrito en el presente documento evaluó la contribución de los CDP para la población PP PDC en ratones receptores que son deficientes en PP PDC (por ejemplo IFNAR ^{- / -} ratones). En experimentos futuros, será importante evaluar el potencial de otros subconjuntos progenitoras en la generación de PDC PP, en particular, si PDC PP derivan de Flt3 ⁺ CLPs. Esta pregunta es importante ya que no queda claro por qué PDC PP son especialmente sensibles a las seña...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C57BL/6J	JAX	664
B6. SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
15 ml Tubos cónicos	BD Biosciences	352095
50 ml Tubos cónicos	BD Biosciences	352070
Pinzas
Tijeras estériles de par pequeño
par grande
40 μ m filtro	de células BD Biosciences	352340
35 μ m tubos de tapón de filtro de células	BD Biosciences	352235
tampón de lisado RBC	Sigma	R7757
tampón			PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filtro esterilizado
Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
Colagenasa IV	Worthington	LS004188
Microperlas IgG anti-ratas de cabra	Milteyni Biotec	130-048-501
Columna LD	Milteyni Biotec	130-042-901
Rata anti-D3	BD Biosciences	555273
Rata anti-CD19	BD Biosciences	553783
Rata anti-CD11b	BD Biosciences	553308
Rata anti-CD11c	BD Biosciences
Rata anti-Ter119	BD Biosciences	553671
Anti-CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
Anti-CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
Anti-CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
Anti-CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
Anti-F4/80 ( PerCP)	eBiosciences	45-4801
Anti-Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
Anti-Sca-1 (PE. Cy7)	eBiosciences	25-5981
Anti-CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
Anti-c-kit (APC. Cy7)	eBiosciences	47-1171
Anti-IL-7R (Pacific Blue)	eBiosciences	48-1271
Anti-Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
Anti-CD45.1 (APC. Cy7)	BD Biosciences	560579
Anti-CD45.2 (PE. Cy7)	Biolegend	109830
Anti-CD11c (Azul Pacífico)	eBiosciences	48-0114
Anti-B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
Anti-Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
Clasificador de células	BD Biosciences		, p. ej. BD Fortessa
Lámpara
de calor Retenedor
1 ml Jeringas	Becton Dickinson
27½ Agujas G (estériles)	Becton Dickinson	305109