Este manuscrito presenta una técnica para aplicar o liberar las fuerzas sobre las células o los tejidos adherentes utilizando estiramiento unidireccional.
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Artículo de método
El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas mecánicas ejercidas sobre las células y / o tejidos juegan un papel importante en numerosos procesos. Hemos desarrollado un dispositivo para estirar las células sembradas en placas sobre un polidimetilsiloxano (PDMS) de membrana, compatible con formación de imágenes. Esta técnica es reproducible y versátil. La membrana de PDMS se puede microestructurada con el fin de confinar las células o tejidos a una geometría específica. El primer paso es imprimir micropatrones en la membrana de PDMS con una técnica de UV profunda. La membrana de PDMS se monta entonces en una camilla mecánica. Una cámara está enlazado en la parte superior de la membrana con grasa biocompatible para permitir el deslizamiento durante el estiramiento. Las células se siembran y permitir que se extienda por varias horas en los micropatrones. La muestra puede ser estirada y no estirada varias veces con el uso de un tornillo micrométrico. Se tarda menos de un minuto para aplicar la recta en toda su extensión (en torno al 30%). La técnica presentada aquí no incluye un dispositivo motorizado, que es necesaria para unapplying ciclos repetidos de estiramiento de forma rápida y / o estiramiento controlado ordenador, pero esto puede ser implementado. El estiramiento de las células o el tejido puede ser de interés para las cuestiones relacionadas con las fuerzas de células, la respuesta celular al estrés mecánico o la morfogénesis de tejidos. Esta presentación en video le mostrará cómo evitar los problemas típicos que pueden surgir cuando se hace este tipo de aparentemente sencillo experimento.
Introducción
Las células que componen un tejido en organismos superiores están sujetos a tensiones mecánicas y fuerzas de estiramiento próximos ya sea desde el ambiente externo o a partir de células que rodean 1,2. Las células deben adaptarse y resistir estas fuerzas a fin de mantener la integridad de los tejidos. Tales fuerzas son también importantes para tejidos morfogénesis durante el desarrollo 3,4. La aplicación de fuerzas mecánicas sobre las células cultivadas es una manera de imitar lo que podría suceder en un tejido, pero con un control cuantitativo e independiente de la forma celular y 5,6 deformación celular. Para ello, pueden utilizarse....
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Protocolo
1. La pasivación de la PDMS
- Corte un pedazo de PDMS aproximadamente 35 mm x 20 mm a partir de una hoja de pre-hechos (por ejemplo, GelPak, que se enumeran en la tabla de materias).
- Quite la parte superior y las capas protectoras inferiores de plástico (si es necesario) y utilizar pinzas para colocar el PDMS en un plástico (no celular cultivo tratado) placa de Petri.
- Lavar el PDMS con etanol al 70% durante 5 minutos en un rotador a 30 oscilaciones / min.
- Seque la superficie por las corrientes de aire en él.
- Iluminar con profunda UV (λ = 180 nm) durante 5 minutos a una distancia de las bombillas UV de unos 5 cm (ver ho....
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Resultados
La técnica presentada en este protocolo de vídeo permite la aplicación de fuerzas sobre las fibras de retracción de las células de mamíferos de la mitosis. De hecho, durante la división celular, en la etapa mitótica, células de mamífero se retraen para tomar la forma de una esfera y dejar atrás los cables de actina delgadas rodeadas por una membrana que se unen al sustrato. Estos cables (fibras de retracción), son la memoria de la geometría de la célula antes de entrar en división. Haciendo micropatrones con UV pr.......
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Discusión
Aunque esta técnica ha sido utilizada en numerosas ocasiones y es sometido a pruebas exhaustivas, hay varios pasos críticos que pueden llevar a un experimento fallido.
Acerca de los PDMS:
Para este trabajo, GelPak, una hoja de PDMS delgada disponible en el mercado, se utilizó. Alternativamente hojas PDMS se puede lanzar directamente desde la mezcla de PDMS. Le recomendamos que utilice GelPak porque es más reproducible, y es menos probable que se rompa en comparación.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue fundada por el Institut Curie, París, Francia. La camilla mecánica fue diseñada por Damien Cuvelier (Institut Curie) y es fabricado por GREM (mecanique-grem.com). El patrón de PDMS fue desarrollado por Ammar Azioune (Universidad de Burdeos II).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Diferentes espesores/pegajosidad están disponibles. Una alternativa podría ser lanzar su PDMS Tú mismo. |
| Grasa de silicona | GE Bayer Siliconas | Baysilone-Paste | Esta es biocompatible |
| Dispositivo de estiramiento | GREM mé Camilla canique | 2011 | |
| EDC (N-(3-dimetilaminopropilo)-N′-clorhidrato de etilcarbodiimida) | Sigma | 3450 | Estable 6 meses a -20 ° C |
| NHS (SAL SÓDICA DE N-Hidroxisulfosuccinimida) | Sigma | 56485 | Proteger de la humedad |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Fotomáscara de cuarzo sintético | Toppan | Take fotomáscara binaria estándar en | |
| fibronectina de cuarzo de plasma bovino | Sigma | F1141 |
Referencias
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18
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Reimpresiones y permisos
