Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Resumen

Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.

Resumen

Muchos microorganismos como las bacterias proliferan extremadamente rápido y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares. Pequeñas fracciones de células en una población siempre tienen mutaciones acumuladas que son perjudiciales o beneficiosas para la célula. Si el efecto de aptitud de una mutación proporciona a la subpoblación una fuerte ventaja de crecimiento selectivo, los individuos de esta subpoblación pueden superar rápidamente e incluso eliminar por completo a sus compañeros inmediatos. Así, los pequeños cambios genéticos y la acumulación selección-impulsada de células que han adquirido mutaciones beneficiosas pueden llevar a un cambio completo del genotipo de una población de la célula. Aquí presentamos un procedimiento para supervisar la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población celular bacteriana a lo largo del tiempo por cocultivación de individuos marcados fluorescentemente de la bacteria modelo Gram-positiva Bacillus subtilis. El método es fácil de realizar y muy ilustrativo para mostrar la competencia intraespecies entre los individuos en una población celular bacteriana.

Introducción

Las bacterias del suelo suelen estar dotadas de redes reguladoras flexibles y amplias capacidades metabólicas. Ambas características permiten a las células ajustar sus vías catabólicas y anabólicas para competir con sus compañeros y otros microorganismos por los nutrientes, que están disponibles en un nicho ecológico dado¹. Sin embargo, si las bacterias son incapaces de adaptarse a su entorno, otros mecanismos pueden explicar la supervivencia de una especie. De hecho, como muchas bacterias proliferan rápidamente y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares, las subpoblaciones pueden haber acumulado espontáneamente mutaciones beneficiosas que....

Protocolo

1. Preparación de placas de agar, medios de cultivo, criostocks y precultivos

1. Prepare los medios de crecimiento y los reactivos requeridos (ver tabla de materiales y reactivos).
2. Raya las cepas de B. subtilis (por ejemplo. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) y BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) expresando uno y dos GDHs activos, respectivamente)² que se utilizarán en el experimento de competencia en placas de agar medio SP para obtener colonias individuales. Incubar las placas durante la noche a 37 ....

Resultados

El método descrito aquí se aplicó con éxito para visualizar la competencia intraespecies en una población celular que consiste en cepas de B. subtilis que fueron etiquetados con los genes cfp e yfp que codifican los fluoróforos CFP y YFP, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3,el método se puede utilizar para visualizar la competencia intraespecies de una manera muy ilustrativa. Al detectar las muestras en áreas pequeñas, la composición clonal de la población celular s.......

Discusión

Se han desarrollado varios métodos para analizar la aptitud competitiva de las bacterias¹⁶. En muchos casos las bacterias fueron etiquetadas con diferentes casetes de resistencia a los antibióticos¹⁷. Similar a nuestro enfoque, el etiquetado de las células con casetes de resistencia a antibióticos permite la evaluación de la aptitud competitiva de las bacterias durante el cocultivo en condiciones de crecimiento definidas. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar la aptitud compe.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(NH4)2SO4	Roth, Alemania	3746
Agar	Difco, EE. UU.	214010
Citrato férrico de amonio (CAF)	Sigma-Aldrich, Alemania	9714
CaCl2	Roth, Alemania	5239
Aplicación de glucosa	, Alemania	A3617
Glicerol	Roth, Alemania	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Alemania	6878
KCl	Applichem, Alemania	A3582
KH2PO4	Roth, Alemania	3904
KOH	Roth, Alemania	6751
MgSO4• 7H2O	Roth, Alemania	P027
MnCl2	Roth, Alemania	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Alemania	102786
NaCl	Roth, Alemania	9265
Caldo de nutrientes	Roth, Alemania	X929
Aplicación de glutamato de potasio	, Alemania	A3712
Triptona	Roth, Alemania	8952
Aplicación de triptófano	, Alemania	A3445
Extracto de levadura	Roth, Alemania	2363
1,5 ml Tubos de reacción	Sarstedt, Alemania	72.690.001
2,0 ml Tubos de reacción	Sarstedt, Alemania	72.691
15 ml Tubos de plástico con tapón de rosca	Sarstedt, Alemania	62.554.001
Placas de Petri	Sarstedt, Alemania	82.1473
1.5 ml Cubetas de poliestireno	Sarstedt, Alemania	67.742
15 ml Tubos de cultivo de vidrio	Marca, Alemania	7790 22
Matraces de 100 ml con tapones de aluminio	Marca, Alemania	928 24
Pipetas de vidrio estériles de 10 ml	Marca, Alemania	278 23
Incubadora (28 y 37 ° C)	Nuevo Brunswick	M1282-0012
Juego de pipetas estándar (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1.000 μ l)	Eppendorf, Alemania	4910 000.034, 4910 000.042,Centrífuga
de sobremesa para tubos de reacción de 1,5 y 2 ml	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Alemania	75002425
Centrífuga de sobremesa para tubos de plástico de 15 ml	Heraeus Biofuge Primo R, Alemania	75005440
Espectrofotómetro estándar	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Alemania	80-2112-21
Microscopio de estereofluorescencia	Zeiss SteREO Lumar V12, Alemania	495008-0009-000
Congelador (-20 y -80 ° C)	-	-
Nevera (4 & grados; C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4,	Alemania-Medidor de
pH	pH-metro 766, Calimatic, Knick, Alemania	766
Vórtice	Vórtice 3, IKA, Alemania	3340000
Balanza	CP2202S, Sartorius, Alemania	reemplazado por
Pluma negra (marcador permanente)	Staedler, Alemania	317-9
Programa de Powerpoint	Microsoft, EE. UU.	-
Office Programa Excel	Microsoft, EE. UU.	-	Programa para el procesamiento de datos
Adobe Photoshop CS5	Adobe, EE. UU	. reemplazado por CS6, descargar	Programa informático para el procesamiento de imágenes
Computadora	PC o Mac-ZEN
pro 2011 software para el microscopio	de fluorescencia estereoscópicaZeiss, Alemania	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtenido a través de Zeiss
Recetas de solución específicas
SP Medio
8 g Caldo
0,25 mg MgSO4• 7H2O
1 g de KCl
15 g de agar para medio			, si es necesario
agregue 1 L con autoclave H2O			durante 20 min a 121 & C
1 ml de CaCl2 (0,5 M), esterilizado por filtración
1 ml de MnCl2 (10 mM), esterilizado por filtración
2 ml de citrato férrico amónico (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración
LB Medio
10 g Triptona
5 g de extracto
10 g de NaCl
15 g de agar para medio			si es necesario
añadir 1 L con autoclave H2O			durante 20 min a 121 & deg; C
C-Glc Mínimo Medio
200 ml 5 x sales C
10 ml L-Triptófano (5 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml de citrato férrico de amonio (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml de
25 ml de glucosa (20%)			esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 121 ° C
añadir 1 L con estéril H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x sales
10 ml L-Triptófano (5 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml de citrato férrico amónico (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml III’ sales
C
añadir 1 L con sales estériles H2O
5 x C
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
add 1 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 &00; C
III' sales
0,232 g MnSO4• 4H2O
12,3 g MgSO4• 7H2O
añadir 1 L con H2O estéril, autoclave durante 20 min a 121 ° C
40% Solución
200 g de ácido
ajuste el pH a 7.0 agregando aproximadamente 80 g de KOH
agregue 0.5 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 & deg; C
0.9% solución salina (NaCl)
añadir 1 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 &°; C
50% Solución
295 ml Glicerol (87%)
añadir 0,5 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 ° C
Bacteria (Todas las cepas se basan en la cepa Bacillus subtilis cepa 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)	Recolección
de laboratorioBacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)

de nutrientes SP sólido, de levadura LB sólido sales III'C 20 ml de glutamato (40%)25 ml de glucosa (20%), esterilizado en autoclave durante 20 min a 121 & deg;de glutamatoL-glutámicode glicerol de cepas