Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Resumen

Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.

Resumen

Muchos microorganismos como las bacterias proliferan extremadamente rápido y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares. Pequeñas fracciones de células en una población siempre tienen mutaciones acumuladas que son perjudiciales o beneficiosas para la célula. Si el efecto de aptitud de una mutación proporciona a la subpoblación una fuerte ventaja de crecimiento selectivo, los individuos de esta subpoblación pueden superar rápidamente e incluso eliminar por completo a sus compañeros inmediatos. Así, los pequeños cambios genéticos y la acumulación selección-impulsada de células que han adquirido mutaciones beneficiosas pueden llevar a un cambio completo del genotipo de una población de la célula. Aquí presentamos un procedimiento para supervisar la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población celular bacteriana a lo largo del tiempo por cocultivación de individuos marcados fluorescentemente de la bacteria modelo Gram-positiva Bacillus subtilis. El método es fácil de realizar y muy ilustrativo para mostrar la competencia intraespecies entre los individuos en una población celular bacteriana.

Introducción

Las bacterias del suelo suelen estar dotadas de redes reguladoras flexibles y amplias capacidades metabólicas. Ambas características permiten a las células ajustar sus vías catabólicas y anabólicas para competir con sus compañeros y otros microorganismos por los nutrientes, que están disponibles en un nicho ecológico dado¹. Sin embargo, si las bacterias son incapaces de adaptarse a su entorno, otros mecanismos pueden explicar la supervivencia de una especie. De hecho, como muchas bacterias proliferan rápidamente y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares, las subpoblaciones pueden haber acumulado espontáneamente mutaciones beneficiosas que proporcionan a las células una ventaja de crecimiento selectivo y, por lo tanto, aumentan su aptitud. Además, los puntos críticos mutacionales y la mutagénesis adaptativa inducida por el estrés pueden facilitar la evolución de una bacteria inadaptada^2,3. Así, la acumulación de mutaciones y el crecimiento bajo selección continua es el origen de la enorme diversidad microbiana, incluso dentro del mismo género^4,5. Al igual que en la naturaleza, la conformación de genomas bacterianos también ocurre en el laboratorio debido al cultivo continuo bajo selección. Esto se ejemplifica en la domesticación de la bacteria Gram-positiva B. subtilis, que se utiliza en todo el mundo en la investigación básica y en la industria. En la década de 1940, B. subtilis fue tratado con rayos X perjudiciales para el ADN, seguidos de un cultivo bajo una condición de crecimiento específica^6. Las mutaciones que se han acumulado en las bacterias durante su domesticación explican la pérdida de muchas características de crecimiento, es decir, la cepa de laboratorio B. subtilis 168 perdió la capacidad de formar colonias complejas^7,8.

Hoy en día, para las bacterias modelo mejor estudiadas Escherichia coli y B. subtilis,una variedad de herramientas poderosas está disponible para manipular genéticamente sus genomas con el fin de abordar cuestiones científicas específicas. A veces la inactivación de un gen de interés causa un defecto de crecimiento severo, que luego es claramente visible en el medio de crecimiento estándar⁹. Por el contrario, las mutaciones que causan un defecto de crecimiento débil y, por lo tanto, solo afectan ligeramente la aptitud de la cepa a menudo se ignoran. Sin embargo, en ambos casos la incubación prolongada y el paso de las cepas mutantes durante varias generaciones suelen dar lugar a la acumulación de mutantes supresores que han restaurado el fenotipo de la cepa madre^2,9. La caracterización de mutantes supresores y la identificación de las mutaciones que han restaurado el defecto de crecimiento de la cepa mutante madre es un enfoque muy útil que permite la elucidación de procesos celulares importantes y a menudo^{novedosos 10,11.}

Estamos interesados en el control de la homeostasis del glutamato en B. subtilis^12. Similar a E. coli, B. subtilis responde a la perturbación de la homeostasis del glutamato(es decir,bloqueo en la degradación del glutamato²⁾por la acumulación de mutantes supresores. Se demostró que las alteraciones genómicas en estos mutantes supresores que fueron adquiridos por mutación espontánea restauran rápidamente la homeostasis del glutamato^9,13. Por lo tanto, no es sorprendente que la adaptación de B. subtilis a una condición de crecimiento específica durante la domesticación de la bacteria se refleje en la síntesis enzimática y en las actividades enzimáticas evolucionadas, que están involucradas en el metabolismo del glutamato^12. Se ha sugerido que la falta de glutamato exógeno en el medio de crecimiento durante el proceso de domesticación fue la fuerza impulsora para la aparición y fijación de la críptica glutamato deshidrogenasa (GDH) del gen GUDB^CR en la cepa de laboratorio 168^2,14. Esta hipótesis es apoyada por nuestra observación de que la cantidad reducida de actividad de GDH en la cepa de laboratorio proporciona a las bacterias una ventaja de crecimiento selectivo cuando el glutamato exógeno es escaso^2. Por otra parte, el cultivo de una cepa de B. subtilis, sintetizando el GDH GudB, en ausencia de glutamato exógeno da lugar a la acumulación de mutantes supresores que han inactivado el gen gudB ^2. Obviamente, la presencia de un GDH catabólicamente activo es desventajosa para la célula porque el glutamato producido endógenamente que de otra manera podría ser utilizado para el anabolismo se degrada a amonio y 2-oxoglutarato(Figura 1). Por el contrario, cuando el glutamato es proporcionado por el medio, una cepa de B. subtilis equipada con actividad GDH de alto nivel tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre una cepa que sintetiza solo un GDH funcional. Es razonable suponer que la actividad de GDH de alto nivel permite a las bacterias utilizar el glutamato como segunda fuente de carbono además de otras fuentes de carbono proporcionadas por el medio² (ver Figura 1). Por lo tanto, la actividad de GDH afecta fuertemente la aptitud de las bacterias, dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno.

Aquí presentamos un método muy ilustrativo para monitorear y visualizar la competencia intraespecípecíta entre dos cepas de B. subtilis que difieren en un solo lugar geométrico en el cromosoma(Figura 2). Las dos cepas fueron etiquetadas con los genes yfp y cfp que codifican los fluoróforos YFP y CFP, y cocultivadas bajo diferentes condiciones nutricionales. Mediante el muestreo a lo largo del tiempo y el enchapado de diluciones apropiadas en placas de agar, los sobrevivientes en cada uno de los cultivos podrían ser fácilmente monitoreados utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo común. El procedimiento descrito en este papel es fácil de realizar y conveniente visualizar la extensión y la eliminación clónicas rápidas de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población de la célula en un cierto plazo.

Protocolo

1. Preparación de placas de agar, medios de cultivo, criostocks y precultivos

1. Prepare los medios de crecimiento y los reactivos requeridos (ver tabla de materiales y reactivos).
2. Raya las cepas de B. subtilis (por ejemplo. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) y BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) expresando uno y dos GDHs activos, respectivamente)² que se utilizarán en el experimento de competencia en placas de agar medio SP para obtener colonias individuales. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
3. Tome colonias individuales e inoculte tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de medio líquido LB. Crecen las bacterias durante la noche a 28 °C y 220 rpm.
4. Crecer cultivos nocturnos a 28 °C para evitar que las células lise o esporular.
5. Mida la densidad óptica de los cultivos a una longitud de onda de 600 nm (OD₆₀₀₎utilizando un espectrofotómetro estándar.
6. Si los cultivos han alcanzado un OD₆₀₀ de 2,0, mezcle 0,75 ml de los cultivos con 0,75 ml de una solución estéril de glicerol al 50% en tubos de reacción de 1,5 ml. El OD_{final 600} debe ser 1.0 para obtener criostocks que contengan aproximadamente 10⁸ células/ml.
7. Guarde los tubos a -80 °C.
8. Hacer tres precultivos de cada cepa etiquetados con los genes de fluoróforo de codificación cfp e yfp. Inocular los precultivos (tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de lb de medio líquido) con células de 1 μl de criostocks de -80 °C. Incubar los cultivos durante la noche a 28 °C y 220 rpm.

2. Cocultivación de bacterias, recolección de muestras y almacenamiento de muestras

1. Preparar recién 100 ml de medio mínimo C-Glc y CE-Glc (ver tabla de reactivos y materiales), y transferir 20 ml de cada medio en matraces estériles de 100 ml.
2. Tomar 0,1 ml de los precultivos que se cultivaron durante la noche, diluirlos con 0,9 ml lb medio en una cubeta de 1,5 ml, y determinar el OD_600.
3. Para el experimento de competición, tome aquellas preculturas de las diferentes cepas que tienen un OD₆₀₀ similar entre 1.0-1.5.
4. Para obtener poblaciones de células mixtas, diluir las células de los precultivos que tenían el OD₆₀₀ adecuado a un OD₆₀₀ de 0,05 en 20 ml C-Glc y CE-Glc medio mínimo complementado en matraces de agitación de 100 ml. Para el experimento de competición, las dos cepas deben mezclarse en una proporción de 1:1.
5. Tome muestras de 10 ml de los frascos, transfiéralos a tubos de plástico de 15 ml, coseche las células por centrifugación durante 10 min a 4.000 x g en una centrífuga de mesa estándar y deseche el sobrenadante.
6. Resuspend las células en 0.5 ml de medio lb fresco, y transferir las células a una taza de reacción estéril de 1.5 ml. Añadir 0,5 ml de glicerol estéril al 50%, mezclar la suspensión mediante un riguroso vórtice y almacenar las muestras en un congelador de -80 °C hasta su posterior tratamiento.
7. Incubar las células que quedan en los frascos de agitación durante un máximo de 24 horas a 37 °C y 220 rpm. Mantenga los frascos de agitación en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico de los fluoróforos.
8. Tomar muestras adicionales de 0,1 ml después de 7 horas y 24 horas de crecimiento. Mida y observe el OD₆₀₀ de diluciones 1:10 (en medio mínimo C-Glc o CE-Glc) de las muestras.
9. Tome la cantidad apropiada de células de cada cultivo para hacer criostocks que tengan un OD₆₀₀ de 1.0. Guarde las muestras a -80 °C hasta su posterior tratamiento.

3. Tratamiento de muestras, revestimiento e incubación para análisis cuantitativos

1. Después de recoger todas las muestras, descongelar los criostocks, y diluir las células en una solución salina al 0,9% (ver tabla de reactivos y materiales) hasta 10^-3.
2. Placa 0.1 ml de las 10^-3 diluciones en placas de agar medio SP y distribuir las células utilizando pipetas de vidrio estériles.
3. Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.

4. Contar a los sobrevivientes por microscopía de fluorescencia estéreo para análisis cuantitativo

1. Divida la parte inferior de la placa de agar con un bolígrafo negro en cuatro partes para una mejor orientación mientras se cuentan los sobrevivientes bajo el microscopio de fluorescencia estéreo.
2. Coloque la placa boca abajo bajo el microscopio y enfoque las colonias usando la fuente de luz fría.
3. Una vez que las colonias están en foco, cambie al conjunto de filtros apropiado para CFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada como CFP. Cuente a los sobrevivientes de esta cepa etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.
4. Retire las etiquetas con etanol y cambie al conjunto de filtros YFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada con yfp. Cuente a los sobrevivientes nuevamente etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.

5. Tratamiento de muestras y microscopía para análisis semicuantitativos

1. Para obtener cifras ilustrativas, spot 10 μl de la dilución^10-4 (aproximadamente 100 células) del paso 3.1 en una placa de agar SP (ver Figura 3).
2. Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.
3. Coloque la placa de Petri sin tapa debajo del microscopio y enfoque el punto usando la fuente de luz fría.
4. Tome fotos de las manchas para las figuras ilustrativas. Elija un tiempo de exposición apropiado para tomar las fotos de las colonias con la fuente de luz fría.
5. Sin mover la placa, cambie al conjunto de filtros CFP, ajuste el tiempo de exposición y tome una foto. Haga lo mismo con el conjunto de filtros YFP y guarde las imágenes para análisis adicionales.

6. Análisis de datos

1. Utilice software como Excel para los análisis de datos cuantitativos. Sobre la base de las colonias contadas, calcular el porcentaje de colonias amarillas y azules con respecto al número total de colonias, que se establecen en 100%.
2. Utilice los números calculados para crear un diagrama de barras apiladas (consulte la figura 4 y la figura 5). Utilice un programa de procesamiento de imágenes como Adobe Photoshop para construir imágenes combinadas de las imágenes tomadas desde los diferentes puntos. Alternativamente, el software de libre acceso ImageJ, descargable desde http://rsbweb.nih.gov/ij/ se puede utilizar para el procesamiento de imágenes.
3. Abra las imágenes desde un punto que se tomaron con el conjunto de filtros CFP y el conjunto de filtros YFP. Optimice el contraste y el brillo para reducir cualquier fluorescencia de fondo del medio.
4. Vaya a una de las imágenes y seleccione todas. Copie la imagen y péguela en la otra imagen.
5. Utilice la función "esquivar el color" para combinar las imágenes o superponer las imágenes fluorescentes utilizando la pestaña de canales. Los cuadros combinados de las colonias de diversos medios y de diversos puntos del tiempo representan el crecimiento de las diversas tensiones dentro de la cultura líquida.

7. Consejos específicos: Experimento de interruptor de tinte y cocultivo de cepas isógenas etiquetadas con cfp y yfp

La expresión de cualquiera de los dos genes que codifican fluoróforos en B. subtilis podría influir en la aptitud y, por lo tanto, en la tasa de crecimiento de las bacterias. Por lo tanto, se recomienda realizar los siguientes experimentos para excluir que la eliminación de una cepa competidora de la población celular durante el cultivo se deba simplemente a un efecto negativo del fluoróforo:

1. Repita todo el experimento y cocultiva las cepas etiquetadas inversamente(por ejemplo, la cepa etiquetada anteriormente con cfpahora está etiquetada con el gen yfp y viceversa). Aunque inversamente, los resultados obtenidos deben ser comparables a la observación anterior de que una cepa tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre la otra cepa.
2. Repita todo el experimento y coculte las cepas isógenas etiquetadas con yfp y cfp (por ejemplo, BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE: :P_gudB-yfp) y BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE: :P_gudB-cfp)). Estimar el efecto negativo de cualquiera de los dos fluoróforos sobre la aptitud de las bacterias siguiendo la composición de la población celular a lo largo del tiempo.

Resultados

El método descrito aquí se aplicó con éxito para visualizar la competencia intraespecies en una población celular que consiste en cepas de B. subtilis que fueron etiquetados con los genes cfp e yfp que codifican los fluoróforos CFP y YFP, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3,el método se puede utilizar para visualizar la competencia intraespecies de una manera muy ilustrativa. Al detectar las muestras en áreas pequeñas, la composición clonal de la población celular s...

Discusión

Se han desarrollado varios métodos para analizar la aptitud competitiva de las bacterias¹⁶. En muchos casos las bacterias fueron etiquetadas con diferentes casetes de resistencia a los antibióticos¹⁷. Similar a nuestro enfoque, el etiquetado de las células con casetes de resistencia a antibióticos permite la evaluación de la aptitud competitiva de las bacterias durante el cocultivo en condiciones de crecimiento definidas. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar la aptitud compe...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(NH4)2SO4	Roth, Alemania	3746
Agar	Difco, EE. UU.	214010
Citrato férrico de amonio (CAF)	Sigma-Aldrich, Alemania	9714
CaCl2	Roth, Alemania	5239
Aplicación de glucosa	, Alemania	A3617
Glicerol	Roth, Alemania	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Alemania	6878
KCl	Applichem, Alemania	A3582
KH2PO4	Roth, Alemania	3904
KOH	Roth, Alemania	6751
MgSO4• 7H2O	Roth, Alemania	P027
MnCl2	Roth, Alemania	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Alemania	102786
NaCl	Roth, Alemania	9265
Caldo de nutrientes	Roth, Alemania	X929
Aplicación de glutamato de potasio	, Alemania	A3712
Triptona	Roth, Alemania	8952
Aplicación de triptófano	, Alemania	A3445
Extracto de levadura	Roth, Alemania	2363
1,5 ml Tubos de reacción	Sarstedt, Alemania	72.690.001
2,0 ml Tubos de reacción	Sarstedt, Alemania	72.691
15 ml Tubos de plástico con tapón de rosca	Sarstedt, Alemania	62.554.001
Placas de Petri	Sarstedt, Alemania	82.1473
1.5 ml Cubetas de poliestireno	Sarstedt, Alemania	67.742
15 ml Tubos de cultivo de vidrio	Marca, Alemania	7790 22
Matraces de 100 ml con tapones de aluminio	Marca, Alemania	928 24
Pipetas de vidrio estériles de 10 ml	Marca, Alemania	278 23
Incubadora (28 y 37 ° C)	Nuevo Brunswick	M1282-0012
Juego de pipetas estándar (2-20 μ l, 10-100 μ l, 100-1.000 μ l)	Eppendorf, Alemania	4910 000.034, 4910 000.042,Centrífuga
de sobremesa para tubos de reacción de 1,5 y 2 ml	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Alemania	75002425
Centrífuga de sobremesa para tubos de plástico de 15 ml	Heraeus Biofuge Primo R, Alemania	75005440
Espectrofotómetro estándar	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Alemania	80-2112-21
Microscopio de estereofluorescencia	Zeiss SteREO Lumar V12, Alemania	495008-0009-000
Congelador (-20 y -80 ° C)	-	-
Nevera (4 & grados; C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4,	Alemania-Medidor de
pH	pH-metro 766, Calimatic, Knick, Alemania	766
Vórtice	Vórtice 3, IKA, Alemania	3340000
Balanza	CP2202S, Sartorius, Alemania	reemplazado por
Pluma negra (marcador permanente)	Staedler, Alemania	317-9
Programa de Powerpoint	Microsoft, EE. UU.	-
Office Programa Excel	Microsoft, EE. UU.	-	Programa para el procesamiento de datos
Adobe Photoshop CS5	Adobe, EE. UU	. reemplazado por CS6, descargar	Programa informático para el procesamiento de imágenes
Computadora	PC o Mac-ZEN
pro 2011 software para el microscopio	de fluorescencia estereoscópicaZeiss, Alemania	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtenido a través de Zeiss
Recetas de solución específicas
SP Medio
8 g Caldo
0,25 mg MgSO4• 7H2O
1 g de KCl
15 g de agar para medio			, si es necesario
agregue 1 L con autoclave H2O			durante 20 min a 121 & C
1 ml de CaCl2 (0,5 M), esterilizado por filtración
1 ml de MnCl2 (10 mM), esterilizado por filtración
2 ml de citrato férrico amónico (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración
LB Medio
10 g Triptona
5 g de extracto
10 g de NaCl
15 g de agar para medio			si es necesario
añadir 1 L con autoclave H2O			durante 20 min a 121 & deg; C
C-Glc Mínimo Medio
200 ml 5 x sales C
10 ml L-Triptófano (5 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml de citrato férrico de amonio (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml de
25 ml de glucosa (20%)			esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 121 ° C
añadir 1 L con estéril H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x sales
10 ml L-Triptófano (5 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml de citrato férrico amónico (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración
10 ml III’ sales
C
añadir 1 L con sales estériles H2O
5 x C
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16,5 g (NH4)2SO4
add 1 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 &00; C
III' sales
0,232 g MnSO4• 4H2O
12,3 g MgSO4• 7H2O
añadir 1 L con H2O estéril, autoclave durante 20 min a 121 ° C
40% Solución
200 g de ácido
ajuste el pH a 7.0 agregando aproximadamente 80 g de KOH
agregue 0.5 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 & deg; C
0.9% solución salina (NaCl)
añadir 1 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 &°; C
50% Solución
295 ml Glicerol (87%)
añadir 0,5 L con autoclave estéril H2O			durante 20 min a 121 ° C
Bacteria (Todas las cepas se basan en la cepa Bacillus subtilis cepa 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)	Recolección
de laboratorioBacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)