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Artículo de método

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

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DOI:

10.3791/51201

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10 de marzo de 2014

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

En este artículo

Resumen

Las células fagocíticas juegan un papel importante en el sistema inmune innato mediante la eliminación y la eliminación de los microorganismos invasores en sus fagosomas. Maduración Fagosoma es el proceso complejo y estrechamente regulado durante el cual un fagosoma naciente se somete a transformación drástica a través de interacciones bien orquestados con diversos orgánulos celulares y los compartimentos en el citoplasma. Este proceso, que es esencial para la función fisiológica de las células fagocíticas dotando fagosomas con sus propiedades líticas y bactericidas, culmina en la fusión de fagosomas con los lisosomas y la biogénesis de fagolisosomas que se considera ser la última y crucial etapa de maduración de los fagosomas. En este reporte se describe un método basado en imágenes de células vivas para el análisis cualitativo y cuantitativo del proceso dinámico de lisosoma al fagosoma de distribución de contenidos, que es un sello distintivo de la biogénesis fagolisosoma. Este enfoque utiliza microperlas recubiertas con IgG como un modelo para phagocytosis y moléculas de dextrano conjugado con fluoróforo como sonda de carga lisosomal luminal, con el fin de seguir la entrega dinámica de contenidos lisosómica de los fagosomas en tiempo real en los macrófagos en vivo utilizando time-lapse y microscopía confocal de barrido láser. A continuación se describe en detalle los antecedentes, los pasos de preparación y la configuración paso a paso experimental para permitir el despliegue fácil y preciso de este método en otros laboratorios. Nuestro método descrito es simple, robusto, y lo más importante, puede ser fácilmente adaptado para estudiar las interacciones phagosomal y maduración en diferentes sistemas y bajo diferentes condiciones experimentales, como el uso de varios tipos de células fagocíticas, experimentos de pérdida de función, diferentes sondas y partículas fagocíticas.

Introducción

Fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos, juegan un crítico en el sistema inmunológico. Además de ser la primera línea de defensa en el sistema inmune innato, sino que también desempeñan un papel crítico en la activación de la inmunidad adaptativa a través de su señalización y presentadora de antígeno papel 1-3. Mientras que la función de los fagocitos profesionales es multifacética, la maduración del fagosoma es la columna vertebral crítico de la función de procesamiento bactericida y el antígeno de los fagocitos profesionales 4,5. Después de la inmersión y la captación de un blanco fagocítica, tales como bacterias mediada por el receptor, el fagosoma naciente pasa a través de una secuencia compleja y bien orquestada de la interacción y los intercambios con compartimentos de la red endocítica y varios otros orgánulos celulares 6. La naturaleza de los compuestos intercambia con estas entidades celulares, así como la regulación y el calendario de eventos de fusión determina el medio phagosomal luminal y los fagoscomposición omal membrana y, por tanto, 7, el destino del fagosoma maduración 8.

La importancia fisiológica de la maduración del fagosoma se ejemplifica con las diversas estrategias empleadas por diversos patógenos intracelulares escapar, arrestar o subvertir fagosoma maduración 9. La mayoría de estas estrategias de evitar directa o indirectamente la etapa final y crítica del proceso de maduración fagosoma: la fusión de fagosoma con compartimientos endosomal / lisosomales finales de los años, que los dota de la mayor parte de las enzimas hidrolíticas y factores anti-bacterianas de un fagosoma madura 7 , 8,10. El análisis de este paso final y crítico, por tanto, nos puede proporcionar fuertes indicadores sobre el estado de maduración de los fagosomas, y si el estado fisiológico natural está siendo positiva o negativamente afectado bajo las condiciones experimentales particulares que se están utilizando.

El compartimento tarde endosomal / lisosomals son generalmente considerados como los compartimentos de terminales de la vía endocítica, definidos y distinguidos de los primeros compartimentos endocítica por la presencia de varios, Escenario, moléculas marcadoras específicas. Por ejemplo enzimas hidrolíticas o componentes de membrana tales como proteínas de la membrana lisosomal asociados (lámparas), entre otros 11. El terminal endocítica que se refiere compartimentos-de ahora en adelante simplemente como lisosomas-también sirven como la ubicación principal para las etapas finales de la digestión en el extremo de la fagocítica / endocítica vía 12. De esta manera, las sondas no digeribles se pueden cargar a través de endocitosis y macropinocitosis desde el medio extracelular y se transportan a través de la vía endocítica a los lisosomas, donde se acumula 13,14 después de seguir un ciclo definido de captación y Chase. Sondas conjugado con fluoróforo para microscopía fluorescente tal como el dextrano polímero orgánico no digerible se utilizan comúnmente como endocyticprobes 15-17.

En este método, se describe la utilización de microperlas recubiertas con IgG como carga fagocítica para investigar la maduración fagosoma mediante el análisis de la entrega de lisosomal contenido luminal a los fagosomas. Mediante el uso de una sonda de dextrano conjugado con fluoróforo como marcador fácilmente detectable de lisosomas en los macrófagos de la médula ósea en directo derivados (BMM) y time-lapse de imágenes de vídeo con un microscopio de escaneo láser confocal, seguimos el proceso dinámico de la entrega de la carga en los fagosomas con alta resolución temporal. A continuación describimos cómo los datos time-lapse recogidos pueden ser evaluados utilizando el código abierto y el software de análisis de imágenes de libre acceso, Fiji (o ImageJ), estadísticamente analizados usando Microsoft Excel y se presenta utilizando el software GraphPad Prism 14,18.

Después de la descripción de nuestro método, experimentos análogos pueden ser diseñados utilizando la configuración y factores modificados para investigar su influencia sobre la maduración fagosoma; prácticamente cualquier OTsu tipo de células fagocíticas primarios o de líneas de células adherentes, la pérdida genética de los experimentos de la función incluyendo genes knock-out y knock-down, mutantes o expresión de proteínas de fusión, fagocíticas-objetivos, compuestos de revestimiento microbead, sondas endosomal / lisosomales y factores como un citoquinas, inhibidores químicos, o ARNsi entre otros son todas las variables que se pueden aplicar para el enfoque básico de este método.

Definimos el objetivo y los requisitos básicos de este método de la siguiente manera:

  • Objetivo del método: para permitir la observación directa, cuantitativa y cualitativa y el análisis de la maduración del fagosoma con alta resolución temporal en las células fagocíticas viviente.
  • Fagocítica de carga: Una micropartícula adecuadamente recubiertos o diana biológica. Aquí se utiliza recubiertas de IgG-3 micras micropartículas esféricas de poliestireno que se internalizan fácilmente mediante el receptor de Fc-γ fagocitosis mediada. Alternativamente, cualquier microorganismo o micrófono revestidoroparticle para que un receptor fagocítico está presente en las células se puede utilizar.
  • Las células fagocíticas: células fagocíticas adherentes que expresan los receptores fagocíticas apropiados. Aquí usamos primarias BMMs de ratón que expresan abundantemente los receptores Fc-γ. Alternativamente, se podrían utilizar células dendríticas (DC), monocitos o células epiteliales fagocíticas o sus mutantes o variantes genéticos knock-out.
  • Lysosomal de carga: Una sonda lisosómico marcado con fluorescencia. Aquí, Texas conjugado-Rojo 70000 kilodaltons de dextrano (Dex70kD) se utiliza como la carga luminal de los lisosomas. Alternativamente, cualquier marcador fluorescente detectable de un compartimiento celular o de orgánulos, o una sonda apropiada para las propiedades phagosomal tales como la acidez o de degradación de la capacidad, se podría utilizar para estudiar la progresión de la maduración del fagosoma.
  • Factores de influencia: por ejemplo, las moléculas de señalización, compuestos químicos, genes knock-down, o la expresión transitoria de proteínas mutantes podían. Aquí, hemos forguno el uso de ese factor en aras de la simplicidad, pero para un ejemplo reciente con la expresión de la proteína mutante y derribo factores que influyen en favor ven Kasmapour et al. 18 Cualquier factor que puede afectar la fagocitosis o por las circunstancias y la movilidad de los fagosomas y / o los compartimentos que interactúan con los fagosomas vencimiento podrían ser utilizadas.

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Protocolo

Cuidado de los animales y todos los procedimientos en este protocolo siguen las directrices institucionales y nacionales.

Preparar los preparativos que se indican mediante "Π" de antemano.

1. Preparación de BMMs

  1. Lleve a cabo el sacrificio de los ratones por dislocación cervical.
  2. Retire fémur y los huesos de tibia, huesos libres desde el tejido y corte los dos extremos de la accesibilidad de la médula ósea.
  3. Mantener los huesos en PBS enfriado con hielo o medio DMEM enfriado con hielo (suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, en hielo hasta el siguiente paso.
    Nota: Lleve a cabo los siguientes pasos bajo un gabinete de bioseguridad clase II para minimizar el riesgo de contaminación.
  4. Enjuague la cavidad medular con PBS frío + penicilina / estreptomicina usando un 26 G (0,45 mm) aguja unida a una jeringa de 1 ml.
  5. Precipitar las células por centrifugación suave a 350 g durante 10 min, resuspender el precipitado en med BMMio y la placa en microbiología estéril no revestidos placas de Petri.
    1. Preparación del medio de BMM
      • Eagles Modificado de Dulbecco medio DMEM
      • 10% de FCS inactivado
      • 20% de fibroblastos de ratón línea celular L929 sobrenadante de cultivo (fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos, M-CSF)
      • 5% de suero de caballo
      • 2 mM de glutamina
    2. Preparación del medio de cultivo línea celular L929;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
      • 10% de FCS inactivado
      • 2 mM de glutamina
    3. Preparación de ratón fibroblastos L929 línea celular sobrenadante del cultivo;
      • Células confluentes L929 se dividieron 1:04, cultivadas en 175 cm 2 frascos de 2 días utilizando 20 ml de medio de L929 y el sobrenadante de cultivo se recogió después de 48 h, se filtró y se añaden a la BMM-medio
  6. Se incuban las células enrojecidos porel fémur en una incubadora a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera.
  7. Después de cada 48 horas (máximo 72 horas) de la incubación, aspirar el medio y reemplazar por medio BMM fresca, para un máximo de 10 días. Más del 95% de las células fueron positivas para CD14 como probado por citometría de flujo. CD14 es un receptor de reconocimiento de patrones expresado principalmente por los macrófagos. Al determinar el porcentaje de células positivas para este receptor, un cultivo puro de BMMs adherentes se ha generado.

Nota: preparar y cultivar las células en consecuencia si se utilizan otros tipos de células.

2. Recubrimiento de Microbeads como fagocítica Cargo

  1. Para la preparación de 1 ml de suspensión de perlas, utilizar 400 l de 2,5% 3 m micropartículas de poliestireno carboxiladas o micropartículas alternativos.
  2. Transferir la suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, lavar 3x con PBS y se añaden 100 l de 500 mM de 2 - (N-morfolino) etanossal sódica del ácido ulfonic, tampón MES a pH 6,7 al sedimento de perlas.
  3. Disolver 50 g de IgG de ratón (anticuerpo IgG policlonal) en 50 l estéril ddH2O y añadir a la suspensión de perlas.
  4. Rellene la suspensión hasta 1 ml con ddH 2 O estéril (450 l).
  5. Incubar la solución durante 15 min en una rueda giratoria a temperatura ambiente.
  6. Preparar un EDAC reticulante, N-(3-dimetilaminopropil)-clorhidrato de N'-etilcarbodiimida en una concentración de 10 mg / ml y añadir 14 l de la suspensión de microesferas.
    Nota: EDAC enlaces cruzados grupos amino de la IgG con los grupos carboxilo en la superficie de las perlas y facilita la inmovilización de la IgG en la superficie de la perla. Esto es crítico para la captación de talón y por lo tanto, la solución debe prepararse recientemente.
  7. Incubar la suspensión en una rueda giratoria durante 1 hora a TA.
  8. Añadir 14 l de un EDAC reticulante y se incuba la suspensión en una rueda giratoria durante 1 hora a TA.
  9. Centrifugar la suspensión a 10.000 xg durante 2 min en una microcentrífuga.
  10. Lavar el perlas 3 veces en tampón de parada (1% de Triton X-100 en 10 mM Tris, pH 9,4) con el fin de detener la reacción de reticulación, resuspendiendo el sedimento en tampón de parada y girar la solución a 10.000 xg durante 2 min.
  11. Lavar perlas de 3x en PBS y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS.
    Opcional: Preparar alícuotas de trabajo de 30 a 50 l.
  12. Guarde la suspensión de perlas con recubrimiento de IgG a 4 º C durante no más de 4 semanas y nunca permita la suspensión a congelar.

Nota: un conservante tal como azida de sodio a una concentración final de 0,02% (w / v) puede ser añadido a la suspensión para evitar el crecimiento bacteriano y la contaminación. En este caso, el lavado de las perlas antes de su uso se tiene que realizar para evitar los efectos citotóxicos de la conservante. Centrifugar una parte alícuota de la suspensión a 10.000 xg durante 2 min y lavar las perlas por REsuspender el sedimento en PBS. Repita el lavado 3 veces.

3. Preparación de la solución madre de dextrano Sonda

  1. Disolver el Rojo Texas 70000 kiloDaltons dextrano (Dex70kD) en PBS a 20 mg / ml y almacenar a -20 ° C, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    Nota: Mantenga las existencias a -20 ° C durante un máximo de varios meses, o bien a 4 º C durante varias semanas, consulte la documentación de los fabricantes.
  2. Preparar la solución de dextrano para el experimento del stock de diluyéndolo en medio completo de cultivo celular DMEM (DMEM, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina) a aproximadamente 1 mg / ml (varias veces solución concentrada que se diluye a la concentración de trabajo final de 20 g / ml antes de la adición a las células).
  3. Use un baño de agua de ultrasonido para sonicar la alícuota de dextrano durante 5 minutos para homogeneizar la solución y disolver los agregados que más tarde podrían dar lugar a la generación de artefactos durante la exploración.
  4. Centrifugar a máxima gdurante 5 min en una microcentrífuga para eliminar los grumos o contaminantes no disueltos de la solución.
  5. Mover con cuidado el sobrenadante a un tubo nuevo evitando al mismo tiempo el sedimento en la parte inferior del tubo y diluir la solución a la concentración de trabajo final de 20 g / ml en medio completo de cultivo celular DMEM.
  6. -Filtro estéril de la solución utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa montada.

4. El dextrano precarga

  1. Se siembran las células en una imagen de células plato con fondo de cristal en vivo y se incuba durante al menos 12 horas (a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO 2) para asegurar el apego y la aclimatación.
    Nota: Hay platos de cristal segmentado inferiores disponibles que permiten la realización de múltiples experimentos (hasta cuatro compartimientos) por plato.
  2. Prepare el dextrano en solución DMEM como se describe en el Protocolo 3. Caliente el dextrano preparado en solución DMEM, usando un baño de agua a 37 ° C.
  3. Aspirar medio de unnd añadir solución de dextrano a las células cuidadosamente y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera durante 2-8 horas para la absorción.
    Nota: Planificar y optimizar el protocolo basado en la sonda y tipo de célula que se utiliza y mantener estrictamente a esta duración al repetir los experimentos. Esto es esencial para el perfil de la acumulación de dextrano en la vía endocítica y por lo tanto la reproducibilidad de los experimentos.
  4. Lavar las células 3 veces con medio completo DMEM precalentado; medio aspirado y enjuague células cuidadosamente con medio fresco.
  5. Se incuban las células con medio completo DMEM durante 4-12 horas a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera.
  6. Lave las células una vez con medio DMEM sin rojo fenol filtrada completa precalentado.
  7. Para obtener resultados óptimos de imagen, cambio de precalentado fenol filtrada medio completo DMEM libre de rojo de al menos 30 minutos antes del inicio de la proyección de imagen. Rojo fenol puede causar extinción de señales fluorescentes, lo que aumenta el ruido de fondo ypor lo tanto reducir el contraste y claridad de imagen.

Nota: Configure el microscopio y los ajustes de imagen de antelación, según el protocolo previamente planificada y optimizada en función del tipo de sonda y las células que se utilizan.

5. Adición de perlas recubiertas con IgG

  1. Equilibrar una alícuota de preprepared 1% suspensión de perlas a temperatura ambiente y someter a ultrasonidos en un baño de agua de ultrasonidos durante 2-3 min.
  2. Añadir 1-6 l de la suspensión de cuentas 1% al medio DMEM libre completa filtrada de fenol rojo debajo de un gabinete de bioseguridad de clase II para minimizar el riesgo de contaminación (una buena concentración inicial es de 1 l / 2 cm2 de superficie de plato).
    Nota: Aquí BMMs se sembraron a 25.000 células / pocillo y un 6 l de 1% de suspensión de stock de talón se añadió al medio en el plato. Esto equivale aproximadamente a una relación grano / celular de 15:01. La relación tiene que ser ajustado al tipo de las células que se utiliza y al material de bolas; i.e. perlas de látex tienen una baja densidad y no se hunden hasta el fondo con rapidez, mientras que las perlas de poliestireno se hunden y se ponen en contacto con las células adherentes mucho más rápido y por lo tanto en mayor número.
    Nota: En función de la experiencia, puede ser una ventaja para seleccionar la región que se observará con antelación. Suspensión de perlas se puede añadir sólo a esa región específica de la placa de fondo de cristal, por lo tanto, el aumento de la probabilidad de observar eventos de captación favorables.
  3. La densa nube de perlas se puede difundir pipeteando suavemente la suspensión en el plato de fondo de vidrio.
  4. Esperar hasta que los granos se hunden hasta el fondo de la placa inferior de vidrio y están aproximadamente en el mismo plano con las células fagocíticas adherentes.
  5. Centrarse en la región de interés (ROI) e iniciar el time-lapse.

Nota: Puede ser necesario ajustar el enfoque mientras la imagen está en curso, en función del sistema de imagen que se utiliza, su estaciónbilidad y la movilidad de las células observadas. Sin embargo, tenga en cuenta que esto puede hacer imposible, el adecuado análisis de los fagosomas que se desvían fuertemente desde el plano de enfoque, como resultado de la reorientación.

6. Imaging

Siga las siguientes indicaciones generales para la calidad de imagen óptima;

  1. Utilice un sistema de imagen confocal, como un sistema de escaneo láser o spinning disco.
    Nota: Se utilizó un Leica TCS SP5 AOBS láser microscopio confocal de barrido controlado por el software Leica LAS AF y equipado con una cámara de control ambiental aquí para obtener imágenes de vídeo time-lapse.
  2. Optimizar los ajustes de imagen como la velocidad de exploración, ampliación, resolución, etc. de una manera para permitir una tasa de una trama en cada 7-20 segundos, dependiendo del sistema utilizado.
    Nota: Aquí, una velocidad de 200 Hz de barrido, zoom 2x escáner y un promediado línea de 2 a 3 veces a una resolución de 512 x 512 píxeles resuLted en un tiempo de grabación entre 3-5 seg / rame. Se utilizó una tasa de un fotograma de cada 10 segundos para grabar películas a intervalos con una duración de al menos 120 min.
  3. Utilice los ajustes de excitación / emisión adecuadas en función del sistema utilizado de imágenes y sonda (s).
    1. Optimizar los ajustes para evitar la excesiva foto-blanqueo.
      Nota: En este caso, el Texas Red dextrano 70 kDa estaba emocionado usando un DPSS (561 nm) de luz láser y la emisión fue detectado por un detector híbrido Leica (HYD) a 600-650 nm, con el pico de emisión a 610 nm. Intensidad del láser tiene que adaptarse a la intensidad de la señal y debe mantenerse lo más bajo posible para reducir al mínimo la foto-blanqueo del fluoróforo (s) y la imagen un efecto de toxicidad de la luz láser sobre las células. En general, es importante equilibrar la velocidad de exploración, con un promedio de línea, resolución de escaneado, el intervalo de fotogramas y la duración de la proyección de imagen para obtener una intensidad de señal adecuada y estable y la captura de la duración completa de la captación del grano y maduración pro fagosomaproceso.
  4. Incluir un canal de campo brillante (BF) para la observación de las perlas si no se conjugan con un fluoróforo.
    Nota: Al lado de la canal Rojo de Texas, se utilizó canal de BF para visualizar las perlas, el mismo láser DPSS se utiliza como se detectó la fuente de luz y la señal con un fotomultiplicador (PMT) del detector.
    Nota: Asegúrese de aplicar los ajustes de grabación idénticos en la adquisición de datos que se va a cotejar. Parámetros más importantes son: la intensidad del láser de excitación, la fijación de detector, los ajustes de adquisición, ampliación y intervalos de trama. No usar intervalos de trama idénticos requerirá un paso de curva de promedio como los puntos de datos de observación no se solaparán (por ejemplo, para cotejar una observación con marcos adquiridos en cada 7 segundos con otro conjunto con marcos en cada 12 seg). Esto aumentaría los pasos necesarios para la evaluación de datos y requerir software adicional con función de curva de promediación, tales como OriginLab 's Origen software Pro estadísticas ( http://www.originlab.com/ ).
  5. Preferiblemente, guardar el video time-lapse en el formato de archivo nativo del sistema de imagen utilizado y evitar la exportación en formatos comprimidos.

Nota: Aquí, películas a intervalos se guardan en el formato Leica LAS AF nativa archivos, que luego fueron importados directamente para abrir en Fiji (LIF.). Fiji es capaz de leer los formatos de archivos nativos de la mayoría de fabricantes de microscopios utilizando el incluido Bio formatos importador de plug-in. Exportar el archivo de película de lapso de tiempo en una serie de imágenes con formato JPG o TIFF o como un archivo de vídeo en un formato contenedor AVI no es necesario ni recomendable. Además de preservar la mejor calidad de imagen posible de la observación original evitando algoritmos de compresión con pérdida (por ejemplo, JPEG), utilizando el formato de archivo nativo microscopio asegura que las intensidades de los meta-datos del fichero (sellos de tiempo, de ampliación, de láser y de adquisición, La configuración del detector, etc) se conserva y está disponible para Fiji. Sin embargo, si por cualquier razón, los archivos de video de lapso de tiempo deben ser exportados en un formato diferente para el análisis, asegúrese de usar los formatos de archivo sin comprimir, como serie de imágenes TIFF y color RGB por separado (rojo, verde, azul) canales ya en esta paso, como Fiji menudo no puede separar con éxito el canal BF de otros canales de color en archivos exportados. Además, asegúrese de conservar los archivos originales de microscopio como referencia.

7. El análisis de los Time-lapse películas

  1. Utilice ImageJ, Fiji o cualquier otro software que proporciona una capacidad de análisis de asociación de señales análogos.
    Nota: Aquí, Fiji se utilizó para el análisis de películas a intervalos. Fiji es una distribución ImageJ que contiene un paquete de procesamiento de imágenes con los menús de herramientas reorganizadas y los plug-ins nativos adicionales, disponibles para su descarga gratuita en http://fiji.sc . El proceso descrito en esta sectade iones se representa en la Figura 2.
  2. Abra el archivo en Fiji haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y elegir el archivo o arrastrando y soltando el archivo en Fiji.
  3. Elija entre las siguientes opciones;
    1. Pila de arte: Ver apila con HyperStack,
    2. Opciones de color: modo de coloreado de color,
    3. Canales Dividir en ventanas separadas: canales en Split (para todos los colores canales RGB que se grabó se abrirán una ventana separada).
  4. En el caso de una serie de imágenes se va a utilizar, cargue la serie a Fiji, vaya a "Archivo", "Importar", "Secuencia de imágenes" y elige cualquier archivo de imagen en la carpeta que contiene la serie de imagen de destino.
    1. Filtros y las condiciones de carga de las imágenes seleccionadas de la serie, por ejemplo Set;
      1. Número de imágenes: la cantidad de fotogramas que desea cargar.
      2. Imagen de inicio: la que la imagen es el marco de partida de la serie.
      3. La subasta: el incremento entremarcos para cargarse (cada cuadro, cada segundo fotograma, etc.).
      4. Nombre de archivo contiene: el filtrado de canal específico usando el nombre del archivo (por ejemplo, mediante el establecimiento de "c001", que es como normalmente se etiquetan las imágenes de "Channel 1" después de la separación de color de un time-lapse video multicanal).
  5. Retire la escala, vaya a "Analizar", "Set escala ...", marcando la casilla "Global" y haciendo clic en "Haga clic para eliminar escamas".
    Nota: Este paso permite que el análisis basado en píxeles de las imágenes en caso de diferentes aumentos han sido utilizados para los distintos juegos de experimentos que se van a evaluar. Si los ajustes de ampliación siempre se han mantenido constantes y el archivo microscopio nativo fue importado directamente a Fiji, este paso se puede omitir, como Fiji puede entender y usar los datos de aumento de escala y de los metadatos del archivo microscopio.
  6. Establecer parámetros de medicións, vaya a "Analizar", "Medidas Set" y marcar las siguientes casillas: "Área", "desviación estándar", "densidad integrado", "etiqueta Display" y "valor de gris medio".
  7. Redireccionar el canal de color que contiene la señal de la sonda que se va a medir y confirmar con "OK".
  8. Ir al marco en el que las mediciones se deberían de empezar y seleccionar la ventana del canal BF haciendo clic en el borde superior de la ventana.
  9. Utilice la opción "herramienta de selección ovalada" para seleccionar una región de interés (ROI), es decir, un ROI circular sobre la perla interiorizado. Asegúrese de que la selección está estrechamente ajustados hasta el borde exterior de la perla como visible en el canal de BF.
    Nota: Si utiliza un PC, mantenga la tecla Shift mientras se utiliza la herramienta de selección para garantizar un ROI circular.
  10. Inicie la medición óptima unos cuantos fotogramas antes de la inmersión total de la perla se completa y tenga en cuenta lamarco en el que se forma un cordón de naciente-fagosoma completamente formado y la copa fagocítica está cerrado. Esto debería ser relativamente claramente discernible en el canal de BF.
  11. Pulsa en "Analizar" y haga clic en "Measure" para ejecutar la medida, el resultado se mostrará en una ventana separada titulada "Resultados".
  12. Ir al siguiente fotograma, ajuste la posición del retorno de la inversión en caso de que el grano se ha movido, y repetir la medición. El resultado será añadido a la lista en la ventana de resultado; cada trama analizada puede ser identificado basándose en el valor en la columna "Etiqueta".
    Nota: El uso de teclas de acceso directo (por ejemplo, "M" para la medida) puede acelerar significativamente el proceso de evaluación, ver la lista de accesos directos y asignar los disfraces en el menú "Plugins".
  13. Después de completar la medición de todos los marcos pertinentes, los resultados se pueden copiar en una aplicación de hoja de cálculo como MS Excel. La columna "IntDen" representa la intensities de la zona seleccionada en el canal que la medición fue redirigido a.

8. Corrección Blanqueamiento

Dependiendo de la sonda utilizada y los ajustes de imagen, se puede producir foto-blanqueo. Dependiendo de su extensión, esto podría afectar fuertemente el resultado de la evaluación. Sin embargo, este efecto puede ser parcialmente corregido mediante la aplicación de una tasa igual pero opuesta de cambio de los valores medidos. Si está presente, el coeficiente de foto-blanqueo se puede calcular midiendo la disminución dependiente del tiempo intensidad de la señal en todo el marco, o área específicamente recortada de la trama, durante el período de tiempo relevante para el análisis de cada fagosoma. Este proceso se representa en las figuras 3 y 4.

  1. Bajo el menú "Plugins" de Fiji, utilice el "Time Series Analyzer" plug-in para determinar la disminución general en el conjunto de fotograma, o la intensidad de la señal de la sonda específica ROI a través del tiempo (Figura 3).
    Nota: Time Series Analyzer plug-in está disponible para su descarga en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , en caso de que no está presente en el menú de Plugins.
  2. Trazar la medición contra el tiempo (en segundos) en MS Excel, sólo para los cuadros que corresponden a los marcos de un fagosoma analizado.
  3. Aplique una línea de tendencia lineal (Figura 4A) a la trama; una pendiente negativa de la señal de la disminución indica la presencia de efecto de foto-blanqueo.
  4. Aplicar la pendiente inversa a los valores de un fagosoma analizado (figuras 4B y 4C): intensidad de la señal corregida (SI) = prima SI + (tiempo en segundos * revertir la pendiente)

Nota: cada sola fagosoma analizado tendrá un período de tiempo específico (a partir de la captación de marco completo) durante una película de lapso de tiempo grabado, la foto-Aclaradores de Uso C.hing debe ser recalculado para ese período específico y sólo será válida para la corrección de los valores medidos a partir de ese fagosoma específico.

9. Evaluación de los datos

  1. Reunir los datos y calcular el promedio y el error estadístico de los valores de blanqueo con corrección en el software apropiado.
  2. Grafica los datos evaluados en la forma adecuada.

Nota: En este caso, las estadísticas científicas y trazando software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ se utilizó). Software Prism es capaz de generar y trazar una curva normal, con los indicadores de error correspondientes, siempre y cuando todos los datos tienen la misma velocidad de cuadro (es decir, todos fueron adquiridos con los mismos intervalos, como un fotograma cada 10 seg).

Nota: Amplias variaciones de los valores absolutos del SI dentro de repeticiones de la misma experimset ent introducirá gran error estadístico y hacer que los datos inutilizables. Este puede ser el caso si el protocolo, por ejemplo, la configuración de imagen, no se llevan a cabo estrictamente idénticos entre diferentes repeticiones de experimentos que han de ser cotejada.

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Resultados

La preparación correcta de las células y los granos para la formación de imágenes es crítico. Figura 1 muestra el esquema de la siembra, la sonda de carga y las etapas iniciales de formación de imágenes en este método, basado en nuestro protocolo optimizado para BMMs. Es esencial por lo tanto, que los parámetros del protocolo de ser probados y optimizados en función del tipo de células y sondas que se van a utilizar.

Después de la adición de las perlas recubiertas con IgG a ...

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Discusión

En la siguiente sección vamos a discutir los pasos críticos del método presentado y sus limitaciones. Además, vamos a conectar algunos de los problemas comunes con sus soluciones, introducir posibles modificaciones y considerar ventajas de nuestro método, así como métodos complementarios adecuados para este enfoque.

La preparación de las perlas, incluyendo el acoplamiento de IgG a la superficie de la perla, es crucial y el uso de preparaciones de filetes debe ser evitado. En adición a eso, t...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Damos las gracias a los miembros del Laboratorio de Biología Fagosoma para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por una beca de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa y los fondos de red de la Asociación Helmholtz) y un Programa Prioritario SPP1580 Grant, del Consejo Alemán de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)PAA, AustriaE15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium sin rojo fenol (D-MEM)PAA, AustriaE15-047
Fetal Bovine Serum (FBS)PAA, AustriaA15-151
L-GlutaminaPAA, AustriaM11-004
PBSPAA, AustriaH15-002
Penicilina/EstreptomicinaPAA, AustriaP11-010
WillCo-dish® Plato con fondo de vidrio (35 mm &vacío;, #1.5)WillCo Wells, Países BajosGWSt-3522
CELLviewTM plato con fondo de vidrio, 35 mmGreiner Bio one, Alemania627871Alternativa: Disponible como
microesferas de látex carboxiladoPolysciences, USA#09850Disponible en diferentes diámetros, utilizamos 3 μ m
Micropartículas de poliestirenoKisker Biotech, AlemaniaPPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, Alemania305.1.3
ratón entero IgGRockland, EE. UU.010-0102
Reticulante EDACSigma-Aldrich, EE. UU.E6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich, EE. UU.T1503
jeringa de 1 ml Omnifix -FB.Braun, Alemania9161406V
26  Aguja G (0.45 * 25 mm)B.Baun, Alemania4657683
RPMI 1640PAA, AustriaE15-039
Suero de caballoGibco, EE. UU16050-122
Hidrato MESSigma-Aldrich, EE. UU.M2933
0.2 μ M filtro de jeringaSartorius, Alemania83.1826.001
segmentadas .

Referencias

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