Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

Resumen

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.

Resumen

Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una "estación de acoplamiento peptídico" en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de "proteína de acoplamiento"-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.

Introducción

Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación ^1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos.

En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Fi....

Protocolo

1. Construcción de plásmidos

NOTA: Todos los genes fueron amplificados bajo reacciones de PCR utilizando Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa según las especificaciones del fabricante. Los cebadores usados ​​para la clonación se han descrito anteriormente ^9. Todos los constructos se enumeran en la Tabla 1.

1. Para generar Cuta-NpuN (N, Tabla 1):
   1. Amplificar por PCR los genes Cuta y NpuN de plásmidos pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ y kanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados.
   2. Digerir estos fragmentos con las enzimas d....

Resultados

Un esquema para la formación de hidrogel de proteína intein mediada se presenta en la Figura 1A. Los bloques de construcción de hidrogel son la proteína copolímeros Cuta-NpuN (N) y NPUC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabla 1). NpuN / C son las N-/C-fragments del DnaE dividir naturalmente inteína de Nostoc punctiforme (Npu). Cuta es una proteína trimérica estable de Pyrococcus horikoshii ^4,5. La mezcla de purificado N y C en la presencia del agente reductor TDT induce la form.......

Discusión

En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hidrogel. La for.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England BioLabs	M0530S
Competente Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
> Luria Bertani	VWR	p>90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Sulfato de kanamicina	VWR
IPTG	VWR	p>EM-5820
Imidazol	VWR	p>EM-5720
Urea	VWR	p>EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	p>82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Precaución, altamente tóxico
Rábano picante peroxidasa	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimetil-p-fenileno diamina	Fisher	AC408460250	Precaución, altamente tóxico
fenol	Fisher	AC149340500	Precaución, altamente tóxico
terc-butil hidroperóxido	Fisher	AC180340050	Precaución, altamente tóxico
n-heptano	Acros Organics	120340010
[encabezado]
Agitador/Incubadora	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrífuga	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Tubos de ultrafiltración	Amicon Ultra	UFC903024
Columna HisTrap de alto rendimiento de	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Columna de intercambio iónico Sepharose FF	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Lector de placas	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM

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