Medición de los cambios en la sensibilidad táctil en la pata trasera de ratones utilizando un aparato electrónico de von Frey

Resumen

Las mediciones electrónicas de von Frey son una alternativa eficaz y mejorada a los filamentos clásicos de von Frey, ya que permiten una medición rápida y precisa de los cambios en los umbrales de retirada mecánica de los roedores a los estímulos de presión aplicados continuamente antes y después de un evento inflamatorio.

Resumen

Medir los cambios inducidos por la inflamación en los umbrales de retirada de la pata trasera por la presión mecánica es una técnica útil para evaluar los cambios en la percepción del dolor en roedores. Los umbrales de abstinencia se pueden medir primero al inicio y luego después de un fármaco, veneno, lesión, alérgeno o inflamación provocada de otro modo aplicando una fuerza precisa en áreas muy específicas de la piel. Un aparato electrónico de von Frey permite una evaluación precisa de los umbrales de retirada de las patas traseras del ratón que no están limitados por los tamaños de filamento disponibles, en contraste con las mediciones clásicas de von Frey. La facilidad y rapidez de las mediciones permiten incorporar la evaluación de los resultados de la sensibilidad táctil en diversos modelos de dolor inflamatorio y neuropático de inicio rápido, ya que se pueden realizar múltiples mediciones en un corto período de tiempo. Las mediciones experimentales para sujetos individuales de roedores pueden controlarse internamente en función de las respuestas iniciales individuales y los criterios de exclusión se pueden establecer fácilmente para estandarizar las respuestas iniciales dentro de los grupos experimentales y entre ellos. Por lo tanto, las mediciones utilizando un aparato electrónico de von Frey representan una modificación útil de los ensayos clásicos basados en filamentos de von Frey para la alodinia mecánica de roedores que también se puede aplicar a otros modelos de mamíferos no humanos.

Introducción

Las enfermedades crónicas no transmisibles son responsables de una parte desproporcionada de la carga humana de mortalidad y morbilidad¹. El dolor crónico se reconoce cada vez más como un componente importante de la carga mundial de morbilidad². Esto ha dado un gran impulso a las innovaciones en la prevención, el tratamiento y el tratamiento del dolor. Al mismo tiempo, existe abundante evidencia de que la biología subyacente del dolor es compleja³. Los mecanismos subyacentes al dolor protector, así como al dolor desadaptativo y crónico, apuntan a una intrincada interacción entre los sistemas inmunológico y nervioso^3,4. La elucidación de estos mecanismos exige enfoques experimentales rigurosos, cuantitativos y reproducibles, desde la disección molecular hasta el análisis del comportamiento.

Los modelos de roedores han sido invaluables en la caracterización de los actores moleculares del dolor inflamatorio y neuropático⁵. La reducción en el tiempo y la intensidad de las respuestas previamente especificadas a los estímulos nocivos se utilizan para medir los estados de dolor en estos animales, ya que los sujetos roedores no pueden informar de otra manera una sensación de dolor⁶. Las respuestas alteradas a la temperatura y la presión se utilizan comúnmente como métricas de la sensibilidad tisular en modelos de roedores de nocicepción inflamatoria que puede ser causada por infección^7,8, exposición química^6,9,10, incisión quirúrgica¹¹, así como dolor neuropático causado por la ligadura de nervios¹².

La sensibilidad mecánica, o la respuesta a los estímulos de presión, a menudo se mide utilizando filamentos clásicos de von Frey (CvF), una serie (por ejemplo, 0,4-15 g¹³) de puntas ponderadas aplicadas manualmente para probar el tejido en incrementos en serie hasta que se inducen comportamientos de dolor en controles frente a sujetos experimentales. Existen varios métodos para utilizar estas puntas o pelos para evaluar la sensibilidad mecánica^6,13; El método más utilizado es el siguiente. Una punta con cierta presión (dentro de la serie; Por ejemplo, 2 g¹³) se selecciona como punto de partida y el umbral de retirada del 50% de una rata o ratón (la intensidad del estímulo necesaria para producir una respuesta el 50% de las veces que la punta se aplica al tejido) se determina moviéndose hacia arriba y hacia abajo en el peso de la punta en función de la visualización de los comportamientos de respuesta especificados anteriormente¹³. A continuación, se comparan los umbrales absolutos de retirada del 50% para los grupos de tratamiento entre los puntos de tiempo iniciales y posteriores al tratamiento. Esta técnica manual requiere bastante tiempo. Además del aumento del tiempo que cada sujeto pasa confinado en una cámara de von Frey, esto también aumenta el número de veces que se aplican puntas de prueba de varios pesos al tejido inflamado, lo que causa una mayor incomodidad a los roedores del estudio. Además, se calculan y comparan umbrales de retirada del 50% entre grupos de roedores; Las respuestas individuales de los sujetos experimentales no suelen normalizarse a sus respuestas basales individuales no tratadas, con, hasta donde sabemos, una excepción⁶. Como consecuencia, los sujetos roedores generalmente no se informan como asignados a los grupos de tratamiento sobre la base de respuestas iniciales consistentes dentro de un rango previamente determinado y tampoco se evalúan los sujetos individuales sobre la base de un conjunto de criterios de exclusión aplicados de manera consistente que permiten estandarizar las respuestas iniciales para cualquier conjunto particular de estudios y ensayos.

Aquí, presentamos un método alternativo para medir la sensibilidad táctil de la pata trasera del ratón después de la exposición al veneno de Bothrops jararaca utilizando un aparato electrónico de von Frey (EvF). Cunha y colaboradores⁶ han sido pioneros en el uso de técnicas de EvF en roedores y han comparado sistemáticamente la eficacia de CvF y EvF para demostrar que EvF proporciona "una medida más sensible, objetiva y cuantitativa" de la sensibilidad táctil en modelos de dolor inflamatorio en roedores. En resumen, en las mediciones de EvF, una punta de von Frey de polipropileno no higroscópico de diámetro uniforme (0,8 mm) de rigidez adecuada para el tejido que se está probando se conecta a una sonda electrónica y una lectura que muestra la fuerza/peso con la que el roedor se retrae de la punta. Hay varias diferencias importantes entre las mediciones de CvF y EvF. En primer lugar, el proceso de medición de las respuestas basales y experimentales utilizando EvF se simplifica en gran medida, ya que la presión sobre la pata trasera se puede aplicar con una fuerza creciente hasta que haya una respuesta y no sea necesario cambiar las puntas como en CvF; Los animales pasan menos tiempo confinados en las cámaras de ensayo y, por lo tanto, están menos estresados y más cómodos durante un experimento. En segundo lugar, la EvF permite una relativa facilidad de implementación de criterios de exclusión racionales para los sujetos de estudio en forma de rangos de umbrales de referencia aceptables. Esto permite la estandarización de las respuestas iniciales dentro de los grupos de tratamiento y entre ellos. En tercer lugar, la respuesta de un sujeto después de un tratamiento experimental siempre se compara con su propia respuesta basal individual, lo que crea importantes controles internos para las mediciones. En cuarto lugar, la precisión de los umbrales de extracción se registra a un nivel más alto de resolución, ya que la presión se puede aplicar de forma continua en lugar de en incrementos disponibles en forma de pesos de filamentos manuales. Al igual que con los ensayos CvF bien diseñados, también se llevan a cabo experimentos basados en EvF con el mismo investigador (ciego al tratamiento) aplicando la fuerza y registrando los comportamientos de respuesta. Es importante tener en cuenta que esta técnica requiere tiempo y esfuerzo por parte de los investigadores para establecer la consistencia interna de las mediciones y requiere que los experimentos se planifiquen de manera que se hagan los márgenes apropiados para los ratones que pueden tener que ser excluidos debido a respuestas de referencia inconsistentes.

Una evaluación fácil de implementar, efectiva y bien controlada de la sensibilidad mecánica facilita la adición de la evaluación del comportamiento a modelos de eventos inflamatorios como el envenenamiento: el ejemplo que hemos utilizado aquí para ilustrar las capacidades y el poder de las mediciones de EvF en la medición de cambios en la sensibilidad táctil. Descubrimos que los ratones suizos ND4 machos mostraron una mayor sensibilidad mecánica después de la inyección de veneno derivado de la víbora sudamericana Bothrops jararaca en la pata trasera. Las respuestas conductuales se acompañaron de edema, afluencia de neutrófilos y degranulación de mastocitos en el tejido afectado.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Macalester College aprobó todos los protocolos. Para estos experimentos se utilizaron ratones suizos ND4 machos de 8-12 semanas de edad.

1. Preparación e inyección del veneno de Bothrops jararaca

1. PRECAUCIÓN: El veneno de B. jararaca es tóxico. Use guantes, mascarilla y protección para los ojos cuando manipule el polvo y prepare soluciones.
2. Administrar 45 μg/kg de veneno de B. jararaca (régimen determinado por experimentos previos de dosis-respuesta) o un vehículo salino al 0,9% (10 μl) mediante inyección intraplantar en ambas patas traseras utilizando jeringas de insulina de 3/10 ml con agujas de 29 G x 1/2. Nota: Dependiendo del diseño experimental, las soluciones de tratamiento y control pueden inyectarse por separado en cada pata trasera, respectivamente, para proporcionar controles internos dentro de cada sujeto.

2. Configuración y operación del aparato electrónico de von Frey

1. Coloque la unidad electrónica von Frey en el soporte de la sonda. Asegúrese de que la sonda y el cable estén correctamente conectados a la unidad de visualización y encienda el instrumento. Ajuste la lectura a cero (0,00 g) en el modo de configuración y coloque suavemente el peso de prueba proporcionado (5,00 g) en el cono de la sonda von Frey.
2. Registre la lectura en un cuaderno de laboratorio y repita este procedimiento al terminar la sesión de prueba. Si hay una discrepancia superior a 0,20 g entre las lecturas del peso de prueba antes y después de la sesión de prueba, o si la lectura fluctúa una vez que se aplica el peso de prueba, puede ser necesario recalibrar el aparato (por parte del fabricante).
3. Para evaluar el umbral de extracción de la pata trasera del ratón, utilice la punta de polipropileno adecuada de entre las suministradas con la sonda. La elección de la punta depende del tejido que se esté sondeando. Las puntas rígidas funcionan bien para el tejido menos sensible y más duro de la pata trasera, mientras que las puntas semiflexibles pueden ser una mejor opción para un área más sensible, como la cresta anogenital (Chatterjea, inédito). Monte suavemente la punta rígida en el cono de la sonda.
4. Para registrar la presión máxima aplicada, cambie el modo de funcionamiento de configuración a funcionamiento de modo que la presión máxima aplicada se registre en la pantalla. En este modo, la lectura de la presión máxima aplicada se guardará en la pantalla de visualización cuando se retraiga la sonda.

3. Consideraciones generales para la evaluación del umbral de retiro de la pata trasera

1. Idealmente, se necesitan dos investigadores para medir el umbral de retiro de las patas traseras (sensibilidad mecánica) utilizando un aparato EvF: uno para operar el aparato y realizar las mediciones, y otro para transcribir las mediciones registradas y manipular ratones.
2. Con el fin de reducir el sesgo, el investigador que opera el aparato debe estar ciego a los tratamientos y a los valores umbral de extracción registrados. Además, para garantizar la coherencia entre las mediciones, la misma persona debe evaluar todos los umbrales de retirada basales y experimentales.
3. Realice todas las mediciones en una habitación tranquila con temperatura controlada y a la misma hora del día¹⁴.
4. El experimentador que registra las mediciones debe colocar cada ratón en cámaras individuales de carcasa de polimetacrilato de metilo (PMMA) de unidades múltiples colocadas en un soporte de suelo de malla. Cubra las cámaras con tapas perforadas de PMMA y coloque un objeto pesado encima para evitar que los ratones se escapen. Coloque material absorbente debajo del soporte para absorber/recoger los desechos excretados. Permita que los ratones se aclimaten durante 15 minutos en cámaras antes de la evaluación basal o experimental del umbral de retiro ^6,7,10.
5. Las patas traseras de los ratones deben ser fácilmente accesibles a través de las aberturas del piso de malla; por lo tanto, coloque el soporte de piso de malla a una altura cómoda en un carro con frenos o en una mesa de trabajo estable que sea accesible desde todos los lados.
6. Durante las mediciones, es posible que los ratones deban distraerse con una bolita de alimento¹⁵ colocada justo fuera de la cámara de medición o con un ruido muy leve producido por golpecitos o pasadas un bolígrafo a lo largo de la malla de alambre del suelo de la cámara antes, pero no durante, la medición. Esto induce al ratón a quedarse quieto, lo que permite al experimentador comenzar a tomar medidas más fácilmente.

4. Evaluación del umbral de retirada de la pata trasera de referencia

1. El primer conjunto de mediciones basales debe realizarse 48 horas antes de administrar el tratamiento. Ponga a cero la sonda al montar la punta rígida. Con las dos manos, levante la sonda lentamente para estimular el centro (área de la almohadilla del pie) de la pata trasera izquierda o derecha (si ambas patas recibieron el mismo tratamiento).
2. Aumente la presión gradualmente hasta que se observen comportamientos de respuesta nociceptiva definidos, como la retracción de la pata trasera, el lamido de la pata trasera o el salto de cuatro patas^6,10. Pida al otro investigador que transcriba la presión que provocó el comportamiento observado.
3. Mida el umbral de extracción del ratón situado en la cámara adyacente. Continúe hasta que haya evaluado los umbrales de retiro de cada mouse una vez. Repita otras cuatro veces, de modo que cada mouse se mida 5 veces como se describió anteriormente¹⁰.
4. Para cada ratón, calcule el valor medio de las 5 mediciones y, a continuación, calcule cuánto se desvía cada valor de la mediana. Seleccione 3 valores que se desvíen lo menos posible y promedie los mismos para obtener un umbral de retiro de referencia como se describió anteriormente¹⁰. En esta demostración, la medición se ha estandarizado utilizando 3 de 5 valores; Si bien el número específico de mediciones puede variar según el diseño experimental, es importante asegurarse de que todos los ratones se pinchen el mismo número de veces para evaluar las líneas de base.
5. Repita las mediciones de referencia 24 horas después. Tome 5 medidas por ratón y promedie las 3 que están más cerca de la mediana para obtener un umbral de retiro de referencia.
6. Para calcular el umbral de retiro de referencia promedio de un ratón, promedie sus umbrales de retiro de referencia tomados a las 48 y 24 horas antes del tratamiento. Si el umbral medio de extracción basal es inferior a 3,50 g, o si los dos umbrales basal difieren en 2,00 g o más, excluya al ratón del experimento. Estos criterios garantizan que todos los ratones del experimento tengan respuestas basales consistentes y umbrales de retirada basales suficientemente altos que permitan observar umbrales más bajos después del tratamiento.
7. Nota: El umbral de exclusión dependerá del tejido que se esté sondeando, la cepa de los animales estudiados y el tipo de punta utilizada. Por ejemplo, hemos encontrado que 3,5 g es un punto de referencia útil para el tejido de la pata trasera ND4, pero las áreas más sensibles, como la cresta anogenital, necesitan un umbral de exclusión más bajo (Chatterjea, no publicado).
8. Asigne a los ratones a los grupos de tratamiento de modo que el promedio de referencia de retiro de los grupos experimentales sea lo más similar posible antes de que se administren los tratamientos.

Nota: Las mediciones de referencia se pueden realizar antes de 48 horas antes de un experimento. Sin embargo, se deben completar al menos 2 series de mediciones de referencia a intervalos regulares antes del inicio de los tratamientos.

5. Evaluación experimental del umbral de retirada de la pata trasera

1. Evaluar el umbral de retirada de las patas traseras (sensibilidad mecánica) después del tratamiento en los momentos apropiados determinados por el diseño del experimento. Regrese a los ratones a sus jaulas con acceso a comida y agua inmediatamente después de que se completen las mediciones.
2. Siga los pasos descritos anteriormente; tome 3 mediciones en lugar de 5 para disminuir la posibilidad de sobreestimular el tejido de la pata trasera (tratado), especialmente si la sensibilidad se va a evaluar en varios puntos de tiempo. Si dos de las tres medidas tomadas difieren en más de 2,00 g, tome una cuarta medida.
3. Calcule el promedio de 3 mediciones para obtener el umbral de retiro experimental para cada ratón. Para cualquier ratón para el que se tomaron 4 mediciones, calcule el promedio de tres que se desvían menos de la mediana, con el fin de obtener el umbral de retiro experimental.
4. Para obtener el umbral de retirada delta para cada ratón en un momento determinado, reste la línea de base del umbral de retirada experimental. Repita para todos los ratones y todos los puntos de tiempo experimentales⁹.
5. Realizar análisis estadísticos apropiados sobre los datos recopilados. Aquí se utilizó JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) para llevar a cabo el análisis ANOVA de un factor y el análisis post hoc de Tukey HSD.

Resultados

La administración local de veneno de B. jararaca provoca cambios en la sensibilidad táctil de la pata trasera y edema tisular en ratones machos suizos ND4.

1,5 horas después de la administración de 45 μg/kg de veneno de B. jararaca, los ratones machos suizos ND4 retiraron sus patas traseras a una presión 3,0 g inferior a la basal (Figura 1A). La retirada basal para todos los grupos se produjo a ~4,5 g de presión aplicada; Después del tratamiento con veneno, los ratones experimentales retiraron sus patas traseras a 1-1,5 g de presión aplicada (datos no mostrados). Los ratones de control tratados con solución salina mostraron poca o ninguna reducción en la respuesta a la presión en comparación con la línea de base en todos los puntos de tiempo probados. La disminución de los umbrales de respuesta en los ratones tratados se mantuvo claramente a las 3 y 6 horas después del envenenamiento (Figura 1A) y fueron indistinguibles de los controles a las 24 horas (datos no mostrados). Las patas traseras de los ratones envenenados mostraron un edema tisular característico de la inflamación. A la 1,5 h después de la administración del veneno, las patas traseras tratadas, medidas como se describió anteriormente¹⁰, eran 1,5 mm más gruesas que al inicio del estudio; el edema se mantuvo a lo largo de 3 y 6 horas (Figura 1B). Por el contrario, las patas tratadas con solución salina no mostraron hinchazón ni cambio en el grosor durante el período experimental. Para el experimento representativo que se muestra aquí, se utilizaron un total de 21 ratones para las mediciones de referencia y se seleccionaron 14 para su inclusión en el experimento. Estos se asignaron a grupos de tratamiento de manera que las respuestas medias de retirada al inicio del estudio fueran de alrededor de 4,5 g para cada grupo en su conjunto.

B. jararaca Los cambios en la sensibilidad táctil inducidos por el veneno van acompañados de degranulación de mastocitos e influjo de neutrófilos en las patas traseras de ratones machos suizos ND4.

Además del aumento de la sensibilidad táctil y el edema tisular, también evaluamos la afluencia de neutrófilos (Figuras 2A-B) y la degranulación de mastocitos (Figuras 2C-D) en las patas traseras de ratones envenenados frente a ratones tratados con solución salina. Los neutrófilos son las primeras células inflamatorias que se reclutan en una lesión desde la circulación y se sabe que median las respuestas nociceptivas inflamatorias^10,16,17. Los mastocitos son células centinela residentes en el tejido¹⁸ y la degranulación de los mastocitos se ha asociado con respuestas nociceptivas en la pata trasera de los ratones¹⁰ y en la duramadre de las ratas¹⁹.

Aquí, encontramos que la afluencia de neutrófilos a las patas traseras envenenadas aumentó casi 1.000 veces en comparación con las patas traseras tratadas con solución salina (Figura 3A) según se evaluó mediante el recuento de secciones 10 de tejido plantar sagital embebido en parafina teñidas con hematoxilina-eosina¹⁰ a 1,5 horas después de la administración del veneno de ratones sacrificados.

En las patas tratadas con solución salina, los mastocitos plantares en el tejido de la pata trasera estaban en gran parte intactos o mostraban una leve degranulación (Figura 3B). Por el contrario, las patas traseras envenenadas mostraron una degranulación moderada y extensa del 15-20% de los mastocitos (Figura 3B). Las secciones de tejido descritas anteriormente se tiñeron con azul de toluidina y se observó el número de gránulos visibles por mastocitos para determinar el estado de degranulación descrito anteriormente¹⁰.

Figura 1. La administración local de veneno de B. jararaca causa cambios en la sensibilidad mecánica de las patas traseras y edema tisular en ratones machos suizos ND4. Los umbrales de extracción basales y el ancho basal de las patas se evaluaron a las 48 y 24 horas antes del tratamiento intraplantar con veneno de B. jararaca (Bjv; 45 μg/kg) o en el vehículo (solución salina) (10 μl). Los umbrales de retiro se evaluaron a las 1,5, 3 y 6 horas después del tratamiento (A). Seevaluó el ancho de la pata (ancho medio de la pata izquierda y derecha de un ratón) en la región plantar media utilizando calibradores digitales al inicio y luego 1,5, 3 y 6 horas después del tratamiento para determinar el edema tisular descrito anteriormente¹⁰ (B). Se comparan las significaciones con ratones tratados con sal (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 respectivamente). n = 10-11 ratones por grupo de tratamiento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. La sensibilidad mecánica inducida por el veneno de B. jararaca se acompaña de degranulación de mastocitos e influjo de neutrófilos en las patas traseras de ratones machos suizos ND4. 3 ratones/tratamiento fueron sacrificados por CO₂ a 1,5 horas después del tratamiento y sus patas traseras fueron extirpadas, almacenadas en formalina al 10% durante 24 horas y transferidas a etanol al 70%, descalcificadas durante 1-2 semanas en EDTA al 15% e incrustadas en parafina. Se tiñeron secciones sagitales de 4 μm con hematoxilina-eosina (A-B) y azul de toluidina (C-D) para visualizar neutrófilos (A-B) y mastocitos (C-D), respectivamente. Las imágenes se adquirieron a 400X y 1.000X como se anotó. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. La sensibilidad mecánica inducida por el veneno de B. jararaca se acompaña de aumentos significativos en los niveles de degranulación de mastocitos y la afluencia de neutrófilos en las patas traseras de ratones machos suizos ND4. Los neutrófilos y los mastocitos en secciones de tejido teñidas se contaron con un microscopio CX21LED Olympus. Los neutrófilos se contaron en 3 patas traseras por tratamiento desde el talón hasta los dedos de los pies en campos de visión adyacentes con un aumento de 400X (A). Los mastocitos se contaron en 3 almohadillas/tratamiento y su estado de degranulación se puntuó en función del número de gránulos visibles fuera del límite de la célula: intactos (0), leves (0-10), moderados (10-20), extensos (21+), como se describió anteriormente¹⁰ (B).  Para evitar contar las mismas células dos veces, los investigadores que evaluaron el número de neutrófilos y los niveles de degranulación de mastocitos en las secciones de las patas traseras utilizaron una cuadrícula inscrita en la retícula del ocular. Las significaciones se comparan con los ratones tratados con Sal (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 respectivamente). n = 3 ratones por grupo de tratamiento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discusión

La medición de los cambios en las respuestas de abstinencia es una herramienta importante utilizada para evaluar los cambios en la sensibilidad táctil en modelos de dolor e inflamación en roedores. Aquí demostramos la utilidad de un aparato electrónico de von Frey para realizar esta evaluación. Hay varias ventajas de esta técnica: i) podemos evaluar rápidamente las respuestas de retirada a la presión aplicada para múltiples ratones en múltiples puntos de tiempo que están bastante juntos, ii) podemos usar una sola punta para aplicar presión continua y específica a un área pequeña de tejido, iii) podemos medir con precisión la presión precisa aplicada para obtener una respuesta de retirada, y iv) podemos implementar fácilmente límites de referencia sólidos, criterios de exclusión y controles internos para garantizar que las evaluaciones de comportamiento sean lo más precisas y objetivas posible.

Los pasos críticos para garantizar los mejores resultados para un ensayo de EvF son la calibración previa del instrumento y las prácticas de medición consistentes. Como se detalla en la sección de protocolo, el instrumento debe manipularse con cuidado y garantizarse una calibración adecuada antes y durante su uso. Antes de realizar cualquier medición, se deben confirmar las lecturas del peso de prueba para garantizar un funcionamiento óptimo de la máquina. Si las lecturas fluctúan significativamente o si las lecturas de la pesa de prueba no son precisas, se debe contactar de inmediato con el fabricante para calibrar el aparato. Teniendo esto en cuenta, es aconsejable tener un aparato electrónico de respaldo de von Frey, si es posible, para no comprometer los experimentos sensibles al tiempo debido a una necesidad inesperada de calibración del instrumento. Además, un solo investigador bien capacitado debe tomar todas las mediciones experimentales y de referencia para un estudio o serie de experimentos determinados, sin dejar de estar cegado a los grupos de tratamiento. Los ratones deben evaluarse en una habitación tranquila, mantenerse a una temperatura constante, aclimatarse a las cámaras de EvF durante al menos 15 minutos, pero no estar sujetos en la cámara más tiempo del necesario (especialmente si se toman múltiples mediciones en un solo día) para minimizar el estrés y las variaciones de comportamiento inducidas por la incomodidad.

Las mediciones de EvF ofrecen mejoras significativas con respecto a las técnicas de CvF existentes. Los investigadores pueden aplicar presión continua y no tienen que cambiar entre puntas de varios pesos como se hace en los experimentos de filamentos CvF⁶. Esto conduce a menos pinchazos en el tejido, lo que es especialmente relevante en el caso de tejido inflamado o lesionado. Se puede medir la presión precisa a la que se produce la retirada frente al uso de mediciones de extracción del 50% que también están limitadas por los pesos de filamento disponibles utilizados en las mediciones de CvF¹³. Debido a que se pueden implementar criterios de exclusión racionales y uniformes (como se discutió anteriormente), los ratones se pueden asignar a grupos experimentales de modo que todos los grupos tengan líneas de base promedio similares al comienzo del experimento. Las mediciones de EvF evalúan los cambios en la respuesta conductual a un estímulo dado, y no las respuestas absolutas en sí. Por lo tanto, el cambio de cada ratón en la respuesta nociceptiva se mide como la diferencia entre sus retiros experimentales individuales y de referencia, lo que proporciona controles internos para cada medición tomada.

Quizás la limitación más significativa de EvF es que, al igual que su contraparte manual, el mismo investigador debe tomar todas las mediciones para una serie particular de mediciones experimentales y de referencia. Esto hace que la ampliación de la técnica sea un desafío desde el punto de vista del tiempo, el personal y el equipo. Encontramos que ~ 20 ratones a la vez (dependiendo de la configuración de las cámaras de ensayo) se pueden medir en 30-45 minutos o menos en múltiples puntos de tiempo siempre que haya al menos 45 minutos entre mediciones. Una consideración relacionada a este respecto es la curva de aprendizaje de los experimentadores individuales. Se debe establecer la consistencia interna antes de que un investigador individual pueda embarcarse en un experimento a gran escala y esto requiere muchas horas de práctica dedicada que involucre mediciones repetidas de respuesta de referencia hasta que se alcance la consistencia deseada. Además, el uso de puntos de referencia implica que no se pueden incluir todos los ratones de referencia para un experimento; Encontramos que el 25-30% de los ratones de referencia por experimento generalmente están excluidos.

En términos de modificaciones y aplicaciones futuras, las mediciones conductuales de EvF agregan una dimensión poderosa a una amplia gama de modelos de inflamación para analizar el dolor agudo y / o crónico concomitante que puede subyacer a patologías inflamatorias. En el envenenamiento, encontramos que los cambios pronunciados y de inicio rápido en la sensibilidad táctil acompañaron los resultados esperados de hinchazón de tejidos, reclutamiento de leucocitos y degranulación de mastocitos en las patas traseras de ratones machos ND4. Estos hallazgos corroboran observaciones previas sobre las contribuciones de los mediadores de mastocitos a la sensibilidad térmica en ratas²⁰ y la sensibilidad mecánica inducida por el veneno de B. jararaca en ratones suizos ND4 medidos con CvF²¹. El protocolo EvF se puede modificar fácilmente para su uso en tejidos distintos de la pata trasera , por ejemplo, el abdomen⁷ y la cresta anogenital⁸ , donde actualmente se usa CvF. Los modelos de roedores de alergias, cicatrización de heridas, neuropatías y otras patologías se pueden adaptar fácilmente para incluir medidas de sensibilidad mecánica en tejidos, incluida y más allá de la pata trasera.

En resumen, EvF es una técnica útil y efectiva que actualiza un enfoque clásico de medición de la nocicepción en roedores y es una nueva herramienta importante para sondear los complejos mecanismos subyacentes del dolor en una amplia gama de modelos de enfermedades.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Los ratones machos suizos ND4	Harlan	0-32	Los ratones utilizados aquí tenían entre 8 y 12 semanas de edad y fueron alojados y utilizados de acuerdo con las directrices de la IACUC de Macaleter College.
Jeringa de insulina de 3 ml/100 con aguja de 29 G 1/2 en BD	BD309301		Deseche después de cada uso en el recipiente apropiado.
B. jararaca veneno	Sigma	V5625	PRECAUCIÓN: Sustancia tóxica. Use protección para los ojos y la piel. Disolver en solución salina estéril al 0,9%.
Aparato electrónico de von Frey; sonda = 90 g de alcance	IITC	2394	Muévalo suavemente y asegúrese de que esté siempre horizontal. Para poner a cero la sonda, presione "Programa" y "Borrar". Para cambiar del modo de configuración al modo de operación, presione "Función" (para la lectura "MH") o "MAX".
Soporte de malla + cámaras de PMMA	IITC	410	Colóquelo en una mesa de trabajo estable o en un carro con cuatro ruedas para acceder a todos los lados.
Solo puntas rígidas electrónicas von Frey, gama de 90 g	IITC	2390	n/a