Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.
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Artículo de método
En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
En este informe se describe una guía paso a paso a la técnica de inyecciones intratecales agujas agudas de una manera no invasiva, es decir, independiente de la implantación del catéter. La limitación técnica de esta técnica quirúrgica se encuentra en la finura de las manos. La inyección es rápida, sobre todo para un investigador entrenado, y dado que la interrupción del tejido con esta técnica es mínima, las inyecciones repetidas son posibles; reacción además inmune a las herramientas de extranjeros (por ej. Catéter) no ocurre, dando así una mejor y más específica leer en voz de la modulación de la médula espinal. Dado que la aplicación de la sustancia se limita en gran parte a la región diana de la médula espinal, los fármacos no necesitan ser aplicado en grandes dosis, y efectos más importante no deseados en otro tejido, como se observa con un suministro sistémico, pueden ser eludidas 1, 2. Además, combinamos esta técnica con la transfección in vivo de ácido nucleico con la ayuda de polyethylenimINE (PEI) de reactivo 3, que proporciona una gran versatilidad para el estudio de funciones de la médula a través de la administración de agentes farmacológicos, así como de genes, ARN, y moduladores de proteínas.
Introducción
La médula espinal es un centro muy importante en una variedad de procesos biológicos fundamentales y funciones fisiológicas, incluyendo el procesamiento y la transmisión de entradas dolorosas (nociceptivo) 4-7. Diversas técnicas experimentales se han desarrollado para facilitar la modulación farmacológica de la médula espinal, tales como la implantación crónica de catéteres intratecales 8, la microinyección de la médula espinal, intratecal y la aguja de inyección 9. Cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas, y dependiendo del paradigma experimento Una técnica podría ser más adecuado que los otros. Considerando que la impla....
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Protocolo
Todos los procedimientos de uso de animales estaban en conformidad con las normas éticas establecidas por la Junta de Gobierno Local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Alemania).
1. Preparación del Complejo siRNA / PEI
La solución de complejo de ARNsi / PEI se prepara utilizando las instrucciones del fabricante de la siguiente manera:
- Solución A: Diluir la cantidad deseada de siRNA con agua estéril (si es necesario) hasta una cuarta parte del volumen final y diluir dicha adicionalmente con una solución de glucosa al 10% hasta la mitad del volumen final. Vortex o mezclar suavemente la pipe....
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Resultados
Con el fin de ilustrar una inyección de éxito, se realizó esta técnica usando Fast tinte verde FCF en ratones adultos C57Bl6 (8-10 semanas de edad). El animal se le permitió recuperarse durante unos minutos después de la inyección para dar tiempo suficiente para que el tinte se extendió y luego mató con una sobredosis de CO 2. Posteriormente, la columna de la vertebrado fue disecada y la médula espinal se expuso. El puntos lagrimales azul correspondiente al colorante difusa, marcó el sitio de la inyección. No.......
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Discusión
Por lo tanto, la técnica de inyecciones intratecales de aguja anteriormente descrito es eficaz, rápido, específicamente localizada-, y no destructiva. Técnicamente, el aspecto más crítico de este procedimiento es el punto de inserción de la aguja en el surco. Es crucial que este procedimiento se realiza con las manos muy tranquilas y paciencia. Como muchos procedimientos quirúrgicos, la formación mejora la tasa de éxito de la inyección. Esto también es importante porque durante un experimento real, esta técnica no propo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| En vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulina III anticuerpo | Sigma | T2200 | |
| Anticuerpo anti-WAVE1 | R& D Sistemas | AF5514 | |
| Tinte verde rápido | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurano | Baxter | ||
| Configuración de isoflurano | Drä ger Lü Beck | ||
| Afeitadora | Wella | ||
| Jeringa Hamilton Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 en aguja de 13 mm | BD Microlance | 304000 | |
| Microscopio Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 imprimación directa para qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 imprimación inversa para qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referencias
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-lik....
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Reimpresiones y permisos
