Artículo de método

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el

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DOI:

10.3791/51231

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11 de marzo de 2014

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1Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

En este artículo

Resumen

Un protocolo se describe que utiliza la anoxia / inanición en C. elegans para modelar la isquemia / reperfusión. Los resultados funcionales incluyen aumento de la mortalidad, anormalidades visibles en los procesos neuronales GFP-etiquetados, y las respuestas conductuales alterados que requieren la función neuronal.

Resumen

Protocolos para la anoxia / inanición en los organismo modelo genético C. elegans simulan isquemia / reperfusión. Los gusanos están separados de los alimentos bacteriana y se colocan bajo la anoxia durante 20 horas (la isquemia simulada), y posteriormente se trasladaron a una atmósfera normal con la comida (reperfusión simulada). Este experimentales resultados de paradigma en aumento de la muerte y el daño neuronal, y las técnicas se presentan para evaluar la viabilidad organismo, alteraciones en la morfología de los procesos de contacto de neuronas, así como la sensibilidad táctil, que representa la salida del comportamiento de la función neuronal. Por último, se describe un método para la construcción de incubadoras hipóxicas utilizando contenedores de almacenamiento de cocina común. La adición de una unidad de control de flujo de masa permite modificaciones que deban introducirse en la mezcla de gases en las incubadoras de encargo, y un baño de agua circulante permite tanto el control de la temperatura y hace que sea fácil de identificar fugas. Este método ofrece una alternativa de bajo costo para comercialmenteunidades disponibles.

Introducción

C. elegans es un nematodo que ha sido ampliamente adoptado como un modelo de organismo eucariota multicelular desde su introducción por Brenner 1. Es un modelo barato, sencillo y versátil, que permite una conexión fácil entre alteraciones genéticas y fenotípicas cambia 2.

La isquemia se caracteriza por una falta de nutrientes y el suministro de oxígeno a un tejido, seguido de reperfusión, cuando una ráfaga de especies reactivas del oxígeno se produce 3 y la mayoría del daño ocurre. En 2002, un modelo de isquemia / reperfusión (IR) en C. elegans fue desarrollado 4 que implica la presentación de todo el gusano a la anoxia, la privación de nutrientes y el estrés por calor durante aproximadamente 20 horas, seguido de 24 horas en condiciones normales. Aunque este modelo es técnicamente una anoxia-inanición (AS) condiciones, la muerte celular se produce a través de mecanismos que se conservan en los mamíferos, incluyendo el daño inducido por oxidantes durante la reperfusión 5. Además, similar a la de los mamíferos IR, daño inducido por AS en C. elegans pueden ser prevenidas por precondicionamiento isquémico 6,7 o preacondicionamiento anestésico 8,9.

Los protocolos siguientes muestran cómo para imitar IR en C. elegans utilizando el modelo como, la forma de puntuación anomalías morfológicas y de comportamiento que resultan de AS, y cómo adaptar el protocolo de una manera que permite que el experimento que se llevó a cabo con una inversión inicial más baja usando una alternativa cámara construida fácilmente-por encargo .

Protocolo

1. C. Crecimiento elegans

  1. Preparar 35 mm Nematodo Crecimiento Medios (NGM) placas de agar sembradas con bacterias OP50, como por métodos de cultivo estándar 1.
  2. Sincronizar C. elegans mediante la colocación de 6 adultos grávidas en una placa de NGM sin ​​semillas. Retire los adultos después de ~ 100 huevos se han establecido (hr ~ 3).
  3. Las placas se incuban durante 3 días a 20 º C, momento en el que los gusanos se han desarrollado hasta la etapa adulta joven y son óptimos para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans se describen en otra parte 10.

2. Materiales para AS

  1. M9 buffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 86 mM, 1 mM MgSO 4) debe ser purgada de oxígeno equilibrando con N 2 (argón también se puede utilizar) durante 30 min antes del experimento y se mantiene rodeado de hielo.
  2. Haz un pequeño agujero (3 mmde ancho) en la tapa de 1,5 ml tubos de microcentrífuga en el que se colocarán los gusanos durante AS. El agujero permite el intercambio de gases sin tener la tapa abierta, ya que esto puede conducir a un exceso de evaporación medios.

3. Anoxia / Inanición

  1. Llevar a cabo todos los experimentos al menos por triplicado.
  2. Añadir 1 ml de tampón de RT, M9 oxigenada a cada placa de 35 mm que contiene gusanos adultos jóvenes cultivadas como se describe anteriormente. Tenga cuidado para evitar la eliminación de las bacterias de la placa (añadir M9 a los bordes en los que no se sembraron las bacterias). Después de ~ 1 min los gusanos deben nadando en el M9.
  3. Escudo una punta de pipeta de 1 ml con BSA al vaso y la expulsión de una solución estéril de BSA al 1%.
  4. Incline con cuidado la placa que contiene los gusanos en tampón M9, retire la M9 desde el mismo lugar en el que se añadió, y colocar la suspensión en los tubos de microcentrífuga preparadas. Dejar reposar en hielo hasta que los gusanos han caído a la parte inferior de los tubos (~ 1-2 Min).
  5. Retire la mayor cantidad de M9 posible sin molestar a los gusanos del tubo (dejando unos 100 l), añadir 1 ml de la M9 y helado purgado con oxígeno y colocar el tubo en hielo hasta que los gusanos depositan en el fondo de nuevo. Repita el último paso de 3x. En el último lavado, eliminar la M9 hasta ~ 100 l permanece en el tubo.
  6. Coloque los tubos con los gusanos en desoxigenada M9 dentro de una cámara anóxica / hipóxica (ver instrucciones abajo, Sección 3.6.1) o, alternativamente, en un contenedor sellado a medida (vea las instrucciones más adelante, sección 3.6.2).
    1. Si un anóxica / hipóxica cámara comercial es para ser utilizado, dejar un poco de M9 purgado dentro de la cámara antes de comenzar el paso 3.5 y repita el paso 3.5 una vez que los gusanos son dentro de la cámara.
    2. Si una cámara personalizada se va a utilizar, una descripción detallada de cómo crear un aparato de bajo costo se presenta al final de este protocolo y ha sido descrito por otro grupo previamente 11. En pocas palabras:
      1. Haga dos agujeros en la tapa 250 de tipo Tupperware ml recipiente y agregue conectores de tubos para ellos. Una de ellas será usada para inyectar la mezcla de gas mientras que el otro será el de salida de gas en un baño de agua.
      2. Coloque los gusanos en la cámara y sellar la cámara con la tapa.
      3. De gas con una constante N 2 de flujo (100 ml / min).
      4. Coloque el recipiente en el interior de un baño de agua a 26 ° C. Asegúrese de que el tubo de salida está bien sumergido en agua por lo que no hay retornos de aire y que no hay fugas en el sistema (aparente por las burbujas que surgen de la propia cámara).
  7. Incubar los gusanos a 26 ° C durante 20 horas.

4. La reperfusión simulado

  1. Después de 20 horas bajo condiciones que, retire los tubos de la cámara de incubación en el aire ambiente.
  2. Pipetear C. elegans con una punta recubierta con BSA (como en el paso 3.3) en un OP50 sembró 35 mm placa de NGM. Incubar las placas a 20 ° C durante 24 horas.Después de esto, los gusanos estarán listos para ser anotado.

5. Identificar Dead Versus vivo Worms

  1. Usando una selección de platino, toque ligeramente la parte superior de la cabeza del gusano. Gusanos vivos se moverán hacia atrás después de ser tocado. Si los gusanos son nonresponsive, anotar muerto. De vez en cuando, un gusano no se moverá hacia atrás, pero puede presentar un ligero movimiento de la cabeza de lado a lado. Aunque técnicamente no es muerto, estos gusanos es casi seguro que vencerá en cuestión de horas, y deben ser marcados como muertos. Si uno espera demasiado tiempo para anotar los gusanos, la eclosión interna de la progenie puede ocurrir y estas "bolsas-de-gusanos" se puede romper, por lo que la detección de los cadáveres muy difícil.
  2. Retire ambos gusanos vivos y muertos de la placa que se computen para evitar conteos duplicados. Los gusanos vivos se pueden mover a una placa separada para realizar ensayos de comportamiento. La cantidad de gusanos que viven en relación con el total se representa como el% de gusanos supervivientes (Figura 1A ).

6. Toque Ensayo de Respuesta

  1. Una descripción detallada de este protocolo ha sido presentado en Hart, Anne C., ed. Comportamiento (3 de julio de 2006), WormBook, ed. El C. elegans Comunitaria de Investigación, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
    1. Para anotar la respuesta táctil, identificar los gusanos que se mueven y toque ligeramente el lateral de la cabeza del tornillo sin fin (cerca de la parte media de la faringe), con una selección de pestañas (Figura 3).
    2. Si el gusano se mueve hacia atrás, anotar lo más sensible, si no, la puntuación por no ajustarse (Figura 1B). Repita este paso 10-15x para cada gusano con intervalos de 10 seg. Sonda al menos 10 gusanos en cada grupo para tener datos precisos. El mismo ensayo se puede usar para evaluar los cambios de locomoción hacia adelante siguiente toque ligero a la pared posterior del cuerpo. Asegúrese de no tocar la cabeza o la cola del gusano, ya que esto estimula un comportamiento distinto.
    3. Por último, encepas de control genético corporativos [N2 Bristol de tipo salvaje para, mec (mecanosensorial) mutante positivo para el negativo - por ejemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar la fuerza con la que tocar los gusanos. Demasiado duro de un estímulo provocará una respuesta de comportamiento en los mutantes mec, demasiado poco no va a provocar un efecto en los controles de tipo salvaje N2.

7. Neuronal Modificaciones

  1. Para visualizar Post como modificaciones neuronales, utilizar una cepa que expresa GFP en las neuronas mec táctiles responden 4,5. Estas neuronas tienen largos procesos que se ejecutan a lo largo de la pared del cuerpo y son fácilmente anotó para anomalías morfológicas. Además, la información morfológica puede ser integrado con medidas de comportamiento de la función neuronal, como se describió anteriormente. Una cepa que se puede utilizar para este propósito es TU2583, que está disponible en el C Centro de Genética elegans y contiene el transgén integrado uIs25 expresando GFP from el promotor MEC-18, o alternativamente TU2562, que contiene un MEC-3 :: GFP fusión integrado.
  2. Preparar una almohadilla de agarosa.
    1. Derrita la agarosa al 2% en agua, traiga a 1x M9 con un 10x, y mantener la solución a 70 ° C.
    2. Coloque una gota (~ 20 l) de esta solución en un portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm) que se ha colocado entre los otros dos diapositivas, cada uno de los cuales tienen una sola pieza de cinta adhesiva en su lado inferior.
    3. Coloque un portaobjetos de vidrio final perpendicular a la primera en la parte superior de la solución de agarosa al 2%, y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Esto debería formar una almohadilla que es el espesor de la cinta.
    4. Retire el carro superior y añadir 10 l de M9 que contenía 0,1% tetramisol, que inmovilizar a los gusanos.
  3. Mueva algunos (~ 10) viven gusanos en la diapositiva de agarosa al 2%. Coloque un cubreobjetos sobre ellos y visualizar GFP usando un microscopio de fluorescencia bajo un objetivo 100X con la iluminación apropiada.
  4. Estropeadoneuronas mostrarán una cadena citosólica de la membrana de patrón de perlas en los procesos, compuesto por punctum múltiple (Figura 2A), y / o anomalías en la que aparecen los procesos para ser rotas (Figura 2B). Número de punto lagrimal y anomalías en las neuronas para cada tornillo sin fin, utilizando un total de al menos 10 gusanos.

8. Cámara hipóxica Lab-hecho

  1. Un estilo Tupperware, envase sellado hermético puede readaptar como una cámara anóxica. Tenga cuidado al seleccionar un contenedor que es tan pequeño como sea posible. Un pequeño contenedor crea un ambiente hipóxico más rápido y es más fácil de encajar en el baño de agua (Figura 4).
  2. Haga dos agujeros en la tapa (se puede hacer con un destornillador o por calentamiento de fórceps y obligando a la tapa) e insertar un conector de plástico o metal que se ajusta el tubo (Figura 5A). Utilice pegamento que se puede colocar bajo el agua, y también se pone duro después del secado, evitando el movimiento deel conector y reducir por lo tanto la posibilidad de fugas (Figura 5B).
  3. El recipiente debe ser colocado en el baño de agua de modo que se sumerge por completo (Figura 4). Para sumergir el recipiente, use un peso de la botella o de un peso de buceo.
  4. Una de las conexiones de tubo se puede utilizar para introducir una mezcla de gas y el otro tubo actuará como un alivio de presión, por lo tanto, se debe dejar bajo el agua, de manera que el contenedor se sella del ambiente externo (Figura 4).
  5. La composición del aire se puede modular mediante el uso de gas por encargo, controladores de flujo de masa o cualquier aparato que mezcla los gases deseados. El flujo de gas debe ser controlado, como de alto flujo puede crear una evaporación excesiva. Por ejemplo, en un recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gas proporcionará buen espacio para los gusanos y un fundente adecuado.
  6. La longitud del tubo debe mantenerse a un mínimo, ya que pueden ser permeables al gas, unallowing la entrada de O 2. Es importante evitar el uso de silicona, de Tygon tubos ya que estos materiales son permeables al intercambio de gases. Preferimos tubos de polipropileno o de nylon. Vidrio o la tubería de metal mantienen los gases bien, pero son también más difíciles de trabajar.

Resultados

Someter C. elegans a 20 horas de la EA a 26 ° C en una cámara de incubación en laboratorio por encargo como se describe (Sección 3.6.2) resultó en una mortalidad significativa (Figura 1 A) 5. Imágenes fluorescentes subsiguiente del punto lagrimal y se rompe en las buenas prácticas agrarias etiquetados procesos neuronales de los sobrevivientes confirmó la presencia de anomalías morfológicas (Figura 2). Los sobrevivientes también respondieron mal a la luz toque la pared del cuerpo (fig. 1B). Este modelo ha sido utilizado por varios grupos para estudiar como la predisposición genética, la intervención del farmacéutico, y la plasticidad metabólica afecta los resultados dependen tanto 4-6,8,9,12,13.

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Figura 1. C. elegans supervivencia y el tacto respuesta despuésAS. A) Porcentaje de gusanos que se exhiben 24 horas después de la AS supervivencia. La cepa N2 es el fondo genético de tipo salvaje, y KWN85 contiene un transgén integrado que etiqueta neuronas mec con las buenas prácticas agrarias. B) Respuesta al tacto estímulos de C. vivir elegans (N2 Strain) después de AS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Toque modificaciones neuronales después de AS. Neurona Touch anormalidades (PLML y PLMR), tales como los procesos y las pausas (A) o la acumulación de agregados de las buenas prácticas agrarias en los procesos de (B) tortuosos fueron monitoreados en sobreviviente anestesiado C. eleg ans después de AS.

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Figura 3. Selección de pestañas. Una selección de las pestañas montado. En la inserción, un detalle de la pestaña pegada a la madera palillo de dientes.

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Figura 4. Fabricada en el laboratorio cámara hipóxica en el interior del baño de agua. Un recipiente cerrado listo para comenzar el experimento. Las flechas indican la entrada de gas y la salida y el peso de la botella se utiliza para evitar que se flotante.

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Figura 5. Detalles de la parte interna y externa de la tapa del recipiente. A) lado externo de la tapa del recipiente, lo que indica el tubo y su conector unido a la previamente hecha agujero. B) lado externo de la tapa del recipiente, lo que indica el conector del tubo colocada en el agujero previamente hecho.

Discusión

Como ha sido ampliamente utilizado en C. elegans para modelar la lesión IR. Algunos puntos clave hay que destacar para este protocolo: C. elegans son resistentes a una amplia gama de lesiones, lo que justifica la necesidad de 3 insultos concomitantes (calor, hambre y anoxia) para lograr la muerte de utilizar este sistema. Solo Anoxia no mata a los gusanos en esta ventana de tiempo 14. Por otra parte, el aumento de temperatura es una tensión adicional, por lo que es importante vigilar de cerca. Estrictamente hablando, la inanición no contribuye significativamente al grado de mortalidad observada 7, de por sí, pero parece reducir la variabilidad entre los distintos recipientes experimentales. Teniendo en cuenta que no puede haber una variabilidad significativa desde el día a día, es muy importante comparar las muestras se ejecutan directamente en paralelo, y para repetir los experimentos durante varios días. En general, los resultados se miden por tres placas separadas de 50 a 100 gusanos / condición experimental y éstos son losn promedio y considerado como una sola réplica experimental. Generalmente, entre siete y nueve repeticiones parecen ser suficiente para lograr o descartar significación estadística.

La etapa de desarrollo de los gusanos utilizados en el experimento también debe ser monitoreado cuidadosamente como la susceptibilidad de las diferentes etapas de AS daño varía significativamente 15,16. El uso de los adultos jóvenes es estándar, y la etapa de larvas (L3 y L4) gusanos parecen ser más resistentes a los efectos dañinos de los AS (datos no publicados).

Este protocolo presenta dos formas de realizar los experimentos, uno usando un aparato de laboratorio a medida (utilizando contenedores de tipo Tupperware y entrada de gas 11) y otra usando una cámara hipóxica comercial 4,6. La anoxia puede lograrse por otros medios que consumen el oxígeno, tal como se describe en otra parte 13,17. El uso de técnicas alternativas para crear un ambiente hipóxico puede cambiar el tiempo de incubación necesario ASpara crear la cantidad deseada de la muerte. Orientación ~ 20% de supervivencia es un punto de partida ideal para el estudio de las intervenciones de protección, mientras que el 80% es igualmente ideal para intervenciones que agravan los efectos perjudiciales de la AS. Otra advertencia importante es el tiempo en el que las puntuaciones de observadores gusanos muertos / vivos. Si el tiempo de análisis se extiende más allá de las 24 horas, los datos pueden ser engañosos, ya gusanos muertos vuelven cada vez más difíciles de identificar. Esto puede ser debido a los cadáveres gusano convertirse relativamente transparente a través del tiempo, pero también al hecho de que los embriones fecundados pueden convertirse en la progenie post-mortem en el interior de las carcasas y perturbar ellos a medida que surgen.

El análisis de la morfología neuronal se puede modificar para observar los patrones de expresión de proteínas 18, la fragmentación nuclear 4 y otros parámetros 19 mediante la sustitución de una cepa de gusano que expresa el marcador codificado genéticamente apropiada. Una advertencia final es que la visualización de laprocesos neuronales se debe hacer a menos de 30 minutos después de la colocación de los gusanos en la diapositiva. Confinamiento de los animales bajo anestesia en las diapositivas durante períodos más largos pueden presentar daños AS-independiente. Ajuste la cantidad de animales por cremallera de acuerdo con el tiempo que se necesita para realizar un seguimiento y analizarlos.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Las figuras 1 y 2 se publicó anteriormente en Free Radical Biology y Medicina (Queliconi et al. 5) y tienen los derechos de autor en poder de Elsevier. Este trabajo fue apoyado por el Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), el Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, el Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), y USPHS GM087483 (KN ). Barbacoa es un estudiante de doctorado con el apoyo de una beca de la FAPESP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
N2  cepaCGCCepa de tipo salvaje.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)CGCTU2583transgén fluorescente integrado utilizado para marcar neuronas táctiles.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

CB1338 mec-3 (e1338)IVCGCCB1338mutante mec-3 canónico que es insensible al tacto.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

Tubo de microcentrífugaEppendorf0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscopio Nikon USATE2000-U
Incubadora de baja temperaturaSheldon Manufacturing Inc.Modelo 2005
SelecciónSe puede preparar un palillo de pestañas colocando una pestaña en un palillo de madera, luego colocando el palillo en una pipeta Pasteur de vidrio (Figura 3).
Cámara hipóxicaCoy8307030Guantera hipóxica equipada con catalizador de paladio y controlador de CO2.
de pestañas

Referencias

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