El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.
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Artículo de método
Cerebro Slice Biotinilación: Una
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Resumen
Resumen
Endocítica tráfico regulado es el mecanismo central facilitar una variedad de eventos neuromoduladores, mediante el control de forma dinámica del receptor, canal de iones, transportador y presentación de la superficie celular en una escala de tiempo de minutos. Hay una gran diversidad de mecanismos que controlan el tráfico endocítica de las proteínas individuales. Los estudios que investigan las bases moleculares de la trata se han basado principalmente en la superficie de biotinilación para medir cuantitativamente los cambios en la expresión de proteínas de superficie de membrana en respuesta a estímulos exógenos y la manipulación genética. Sin embargo, este enfoque se ha limitado principalmente a las células cultivadas, que pueden no reflejar fielmente los mecanismos fisiológicamente relevantes en juego en las neuronas adultas. Por otra parte, los enfoques de células cultivadas pueden subestimar las diferencias específicas de la región en los mecanismos de la trata. Aquí se describe un enfoque que se extiende biotinilación superficie de la célula a la preparación de cortes de cerebro aguda. Nosotrosdemuestran que este método ofrece un enfoque de alta fidelidad para medir los cambios rápidos en los niveles de proteínas de superficie de membrana en las neuronas adultas. Este enfoque es probable que tenga una amplia utilidad en el ámbito del tráfico neuronal endocítica.
Introducción
Endocítica tráfico es un mecanismo celular ubicua que afina la presentación membrana plasmática de una variedad de proteínas integrales de membrana. Endocitosis proporciona nutrientes vitales para el medio intracelular 1 y desensibiliza la señalización del receptor en respuesta a la activación del receptor 2. Endocítica reciclar de nuevo a la membrana de plasma puede mejorar adicionalmente la señalización celular mediante el aumento de los niveles de expresión de proteínas en la superficie celular 3. Por otra parte, las perturbaciones de transporte de membrana están implicadas en numerosas enfermedades y condiciones patológicas 4....
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Protocolo
Todo el manejo de animales y la recolección de tejido se realizó de acuerdo con las directrices de la Universidad de Massachusetts Medical School Comité de Uso Institucional Cuidado de Animales (IACUC), siguiendo el protocolo aprobado # A1506 (Melikian, PI).
Soluciones requeridas
Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) - Hacer fresco todos los días
NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3, y 11 mM de glucosa
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Resultados
El transportador de dopamina neuronal se internaliza en respuesta a la activación de PKC en líneas celulares de 16-20. A pesar de muchos informes que demuestran las pérdidas de superficie DAT inducidas por la PKC en una variedad de líneas celulares y sistemas de expresión, ha sido un reto para confirmar este hallazgo en las neuronas dopaminérgicas cultivadas 21-23. Se utilizó rodajas de cuerpo estriado de ratón para probar directamente si DAT internaliza en respuesta a la activación de PKC en las n.......
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Discusión
A pesar del conocimiento de muchos años que el tráfico endocítica críticamente impactos de señalización sináptica en el cerebro, que ha resultado ser un desafío para medir cuantitativamente los cambios en la expresión de superficie de la proteína en las neuronas adultas. En este trabajo, se presenta un enfoque fiable para etiquetar proteína de la superficie ex vivo en rodajas de cerebro agudas. Preparaciones de cortes de cerebro tienen una larga historia de utilidad para los registros electrofisiológicos, ya qu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros que estén en conflicto con esta obra.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones DA15169 y DA035224 en HEM
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-biotina | Pierce | 21331 | |
| Estreptavidina agarosa | Pierce | 20347 | |
| Albúmina sérica bovina sin IgG y sin proteasa | Sigma | A3059 | |
| Seccionador de micrótomo vibratorio | varios | ||
| agua agitado | varios | ||
| Insertos con fondo de malla Millicell (8 & micro; m tamaño de poro) | Millipore | PI8P 012 50 | Se pueden lavar a mano y reutilizar |
Referencias
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R.
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Reimpresiones y permisos
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