Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

Resumen

origami de ADN es un poderoso método para fabricar objetos precisos a nanoescala mediante la programación del autoensamblaje de moléculas de ADN. Aquí describimos un protocolo para el plegamiento de un robot bio-sensible a partir de origami de ADN, su purificación y tinción negativa para la transmisión de imágenes microscópicas electrónicas (TEM).

Resumen

El nanorobot de ADN es un dispositivo nanométrico hexagonal hueco, diseñado para abrirse en respuesta a estímulos específicos y presente de carga secuestradas en el interior. Ambos estímulos y carga se pueden adaptar según las necesidades específicas. Aquí se describe el protocolo de fabricación nanorobot de ADN, con el uso de la técnica de origami de ADN. El procedimiento se inicia mediante la mezcla de alimentos básicos de ADN de una sola hebra cortos en una mezcla de valores que se añade a una larga y circular, andamio ADN de una sola hebra en presencia de un tampón de plegado. Un ciclador térmico estándar de está programado para disminuir gradualmente la temperatura de reacción de mezcla para facilitar el recocido-grapas a andamio, que es la fuerza de guía detrás el plegado de la nanorobot. Una vez que la reacción de plegado 60 hr es completa, el exceso de grapas se descartan usando un filtro de centrífuga, seguido por visualización a través de electroforesis en gel de agarosa (AGE). Por último, la fabricación con éxito de la nanorobot es verificado por microscopía electrónica de transmisión (TEM),con el uso de uranilo-formiato como tinción negativa.

Introducción

Los usos de los ácidos nucleicos de la nanotecnología son asombrosos. La maleabilidad de la base de emparejamiento Watson-Crick, así como la facilidad y bajo costo relativo de la síntesis a gran escala de oligonucleótidos medida ² ha generado una explosión de aplicaciones ³ y la investigación en el campo de la nanotecnología de ADN. Nanotecnología de ADN estructural, basado en el ^4,5 unión Seeman inmóvil como un bloque de construcción fundamental hace uso de ADN como una unidad elemental auto-montaje para la construcción de formas arbitrarias ^6-8.

El reciente desarrollo de la DNA andamiaje origa....

Protocolo

1. Preparación de Grapas piscina Mezcla

1. Solicitar liofilizado ADN grapas nanorobot en placas de 96 pocillos que se enumeran en la Tabla 1 (ver Materiales) y normalizar a 10 nmol. Para obtener una descripción detallada del diseño y la arquitectura del nanorobot de ADN ver Ben-Ishay et. Al ¹⁴ y Douglas et al. ^15).
2. Reconstituir cada grapa bien con DNasa / ultrapura RNasa libre a una concentración de 100 mM. Para grapas normalizaron a 10 nmol, reconstituir con 100 l de agua ultrapura.
3. Piscina juntos 20 l de cada grapa utilizando una pipeta multicanal y 55 ml cuenca so....

Resultados

Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Todos los carriles contienen 1 g de ADN total, medida a través de espectrofotómetro (OD _260). En comparación con el andamio de ADN de una sola hebra circular (carril 2), nanorobots se ven obstaculizados en el gel debido a su peso molecular más alto, el resultado de grapas hibridación con el ADN de andamio (Carril 3. Red flecha). La banda de bajo peso molecular en el carril 3 representa el exceso de alimentos básicos .......

Discusión

Hemos descrito la fabricación, la purificación, y la visualización del nanorobot ADN. Después de la fabricación del chasis hexagonal del dispositivo, la función de la nanorobot está programado con la simple introducción de la carga específica y hebras de detección para el robot que encontrar fácilmente su posición designada debido a la complementariedad de enlaces de hidrógeno con los sitios de conexión disponibles sola ^hebra 14 ^{, 15,22.}

El protocolo de fabricación desc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua destilada sin DNasa/RNasa	Gibco	10977
M13mp18 andamio ssDNA	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0,5 ml filtro centrífugo 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarosa	Promega	V3125
TBE tampón	Promega	V4251
Bromuro de etidio 10  mg/ml solución	Sigma Aldrich	E1510
1 kb marcador de ADN	NEB	N3232S
Colorante de carga	NEB	B7021S
formiato de uranilo	polysciences	24762
rejillas TEM recubiertas de carbono	Servicios científicos	EFCF400-Cu-50
Termociclador c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
Mesa UV Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai