Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Summary

Amidas terciarias péptido (PTA) son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos, peptoides y péptidos N-metilado. Aquí se describe un método de síntesis que combina estrategias de sub-monómero división y piscina y para sintetizar un solo grano de la biblioteca de un compuesto de las PTA.

Abstract

Peptidomiméticos son una gran fuente de proteínas ligandos. La naturaleza oligomérica de estos compuestos nos permite acceder a las grandes bibliotecas sintéticos en fase sólida mediante el uso de la química combinatoria. Una de las clases más estudiados de peptidomiméticos es peptoides. Los peptoides son fáciles de sintetizar y han demostrado ser resistentes a la proteolisis-y-permeable a las células. Durante la última década, muchos ligandos proteicos útiles han sido identificados a través de la selección de bibliotecas de peptoides. Sin embargo, la mayoría de los ligandos identificados a partir de las bibliotecas de peptoides Excluir alta afinidad, salvo raras excepciones. Esto puede ser debido, en parte, a la falta de centros quirales y restricciones conformacionales en moléculas de peptoides. Recientemente, hemos descrito una nueva ruta sintética para acceder amidas terciarias de péptidos (ACP). PTA son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos, peptoides y péptidos N-metilado. Con cadenas laterales en ambos principales átomos de nitrógeno de la cadena α-carbono y,la conformación de estas moléculas se ven limitados en gran medida por impedimento estérico y alílico 1,3 cepa. (Figura 1) Nuestro estudio sugiere que estas moléculas PTA están altamente estructurados en solución y pueden ser utilizados para identificar ligandos de proteínas. Creemos que estas moléculas pueden ser una futura fuente de ligandos de proteínas de alta afinidad. A continuación se describe el método sintético que combina el poder de ambos estrategias sub-monómero división y piscina y para sintetizar una muestra de una perla de un compuesto (OBOC) Biblioteca de los ACP.

Introduction

Los peptidomiméticos son compuestos que imitan la estructura de los péptidos naturales. Están diseñados para retener la bioactividad, mientras que superar algunos de los problemas asociados con los péptidos naturales, incluyendo la permeabilidad celular y estabilidad frente a la proteolisis ^1-3. Debido a la naturaleza oligomérica de estos compuestos, grandes bibliotecas sintéticas se puede acceder fácilmente a través de rutas sintéticas monoméricos o sub-monoméricos ^4-7. Una de las clases más estudiados de peptidomiméticos es peptoides. Los peptoides son oligómeros de glicinas N-alquilados que se pueden sintetizar fácilmente usando una estrategia de sub-monómero ^{8, 9.} Muchos ligandos proteicos útiles se han identificado con éxito a partir de la selección de grandes bibliotecas de peptoides sintética contra objetivos proteicos ^{1, 10-14.} No obstante, "hits" identificados a partir de las bibliotecas de peptoides raramente archivo muy alta afinidad hacia dianas proteicas ^1,10-14,22. Una major diferencia entre peptoides y péptidos naturales es que la mayoría de los peptoides generalmente carecen de la capacidad de formar una estructura secundaria debido a la falta de centros quirales y restricciones conformacionales. Para resolver este problema, se han desarrollado múltiples estrategias en la última década, en gran parte se centra en la modificación de las cadenas laterales contenidos en las principales cadena de átomos de nitrógeno ^{de 15-22.} Recientemente, hemos desarrollado una nueva ruta sintética para introducir cadenas laterales de aminoácidos naturales en una cadena principal de peptoide para crear péptidos amidas terciarias ^23.

Amidas terciarias péptido (PTA) son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos _(R2 = H), peptoides _(R1 = H) y los péptidos N-metilado (R ≠ ₁ H, _R2 = Me) . (Ver Figura 1) Nuestra ruta sintética emplea aminoácidos de origen natural como la fuente de quiralidad y con unas cadenas en el45;-carbono, y aminas primarias disponibles en el mercado para proporcionar N-sustituciones. Por lo tanto, un espacio químico mayor que el de los péptidos simples, peptoides o péptidos N-metilado puede ser explorado. Los espectros de dicroísmo circular han demostrado que las moléculas de la PTA están altamente estructurados de solución. Caracterización de uno de los complejos proteína-PTA muestra claramente que se requieren las restricciones conformacionales de la PTA para la unión. Recientemente, también hemos descubierto que algunas de las moléculas de la PTA poseen una mejor permeabilidad de la célula que sus contrapartes de peptoides y péptidos. Creemos que estas bibliotecas PTA pueden ser una buena fuente de ligandos de alta afinidad para dianas proteicas. En este artículo, vamos a discutir la síntesis de una muestra de una perla de un compuesto (OBOC) Biblioteca de PTA en los detalles, junto con algunas condiciones mejoradas para el acoplamiento y la escisión de estos compuestos.

Protocol

1. Fundamentos de Split-y-piscina Síntesis

Con el fin de generar eficientemente un gran número de compuestos en fase sólida, la síntesis de división y la piscina se emplea a menudo como una estrategia general. Como se muestra en la Figura 4, TentaGel perlas son primero se dividió en tres porciones. Cada porción se hace reaccionar con un reactivo diferente, generando el primer residuo sobre perlas. Después de la primera reacción, todas las tres porciones se combinaron juntos, se mezclan, y después se dividieron de nuevo en tres porciones. Cada porción volverá a reaccionar con un reactivo diferente, generando el segundo residuo sobre perlas. Después de dos pasos división y la piscina, se generan nueve compuestos.

En la síntesis de sub-monómero, perlas se dividan primero en varias porciones para reaccionar con diferentes ácidos bromo en presencia de reactivo de acoplamiento. Después de lavar con disolvente, todas las perlas se agruparon juntos y se mezclan, a continuación, de nuevo dividido en varias porciones para reaccionar con diferenteaminas primarias. Después de aminación, todas las cuentas se agruparon y se lavan a fondo, completando un monómero completa en cada cuenta. Este proceso se puede repetir hasta que se alcanza la diversidad deseada.

2. Preparación de ácido Bromuro de aminoácidos naturales

En la síntesis de sub-monómero, la síntesis de cada monómero se divide en dos etapas separadas:. 1 de acoplamiento de bromuro de ácido y 2 aminación con aminas primarias (Figura 2).. Con el fin de sintetizar una amida terciaria péptido, bromuros de ácido quiral con cadenas laterales en el carbono alfa se preparan a partir de los aminoácidos naturales. A continuación se describe el método de transformación de un aminoácido natural en el bromuro de ácido correspondiente con una alta fidelidad estéreo. Utilizamos alanina como un ejemplo; otros aminoácidos que incluyen serina, treonina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, glicina, valina, isoleucina, fenilalanina también se pueden transformar en ácidos bromo bajo conditio similaresns. Tenga en cuenta que algunos de los aminoácidos con grupos funcionales como fenol, guanidina y amina necesitan ser protegidos antes de la transformación. La configuración de reacción se muestra en la Figura 3.

Precauciones de seguridad: Para que se necesitan los siguientes reacciones que involucran HBr, _NaNO2 y otros productos químicos corrosivos / tóxicos, equipo de seguridad adecuado, como gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes resistentes a productos químicos. Todas las reacciones se deben realizar en una campana extractora por el químico experto.

1. Añadir 370 ml de agua en 630 ml de solución de HBr al 48% para preparar un 1 L, solución de HBr al 30%. Añadir 500 ml de etilenglicol en un recipiente de baño de 1 L; agregue hielo seco para mantener la temperatura a -10 ° C. Precaución: solución de HBr al 48% es muy ácido y corrosivo, manejar con cuidado. Lea la MSDS antes de usar.
2. Añadir D-alanina (8,9 g, 0,1 mol) y KBr (11,9 g, 0,1 moles) a un ml de tres bocas matraz de fondo redondo de 250 con una barra de agitación magnética. Añadir 100 ml, y el HBr al 30% preparado en tque paso anterior. Poner el matraz en el baño de glicol de etileno preparado en el paso 2.1 y mantener la temperatura a -10 ° C. Burbuja de argón a través de una aguja larga de la parte inferior del matraz durante 10 min como se muestra en la Figura 3. Agitar la solución con la barra de agitación magnética a 300 rpm.
3. Disolver _NaNO2 (8,28 g, 0,12 mol) en un vaso de precipitados de 100 ml con 20 ml de agua. Añadir la solución en el embudo de goteo de igualación de presión y sellar el embudo de goteo con un septo. Gire lentamente la válvula del embudo de goteo y se dejó que la solución de _NaNO2 gota en el matraz. Controlar la válvula para ajustar el índice de goteo a aproximadamente 2 gotas por segundo. Mantener la agitación a 300 rpm y mantener el burbujeo de argón desde el fondo del matraz. El matraz se debe mantener en el baño de etileno glicol a -10 ° C hasta que se añade todo de NaNO _2. Precaución: Este paso genera calor y de gas durante la adición de la solución de NaNO _2. Tasa de goteo debe ser cuidadosamente estafatrolled y todo el sistema debe ser abierto a través de la toma de corriente de argón.
4. Mantener la agitación durante 3 horas más y dejó que la temperatura de calentamiento de -10 ° C a la temperatura ambiente. La solución resultante debe ser transparente a amarillo claro; si el color es demasiado oscuro, aplicar vacío para eliminar los óxidos de nitrógeno en exceso y posible Br ₂ generado durante la reacción.
5. Se extrae el producto de la solución con 3x 35 ml de dietil éter utilizando un embudo de extracción. Combinar la fase orgánica y se lava con salmuera saturada. La fase orgánica también se puede lavar con una pequeña cantidad de _NaHCO3 antes de lavar con salmuera para eliminar el color si es de noche. Se seca la fase orgánica sobre Na ₂ SO ₄ durante 6 horas.
6. Filtrar el Na ₂ SO ₄ y se evapora el disolvente a vacío, el producto crudo se debe obtener tan claro para aceite amarillo pálido. El producto bruto puede purificarse adicionalmente por destilación a 115 ° C, 3 mm Hg, o porcolumna de sílice con 3:1 de hexano: acetato de etilo.
7. El producto puro se obtuvo en forma de aceite claro, 6,6 g (rendimiento 74%), densidad = 1,69 g / ml, [α] D20 = 24 ° (metanol), ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3) δ 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). En el caso de (S)-2-bromopropanoico ácido _d-4 (preparado a partir de ₄ D-L-alanina), producto puro se obtuvo en forma de aceite transparente, rendimiento 78%, densidad = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (metanol). ¹ H RMN, no se observa ninguna señal de H significativa. ESI-MS ^- [M-1] ^- = 155,1 (154,97 espera). Para (S)-4-metilpentanoico 2-bromo-ácido (preparado a partir de L-leucina utilizando el mismo procedimiento) de producto puro se obtuvo en forma de aceite transparente, rendimiento 89%, [α] D20 = 37 ° (metanol), ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3) δ 4,30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). En el caso de (S)-2-bromo-3-Pheácido nylpropanoic (preparado a partir de L-fenilalanina utilizando el mismo procedimiento) de producto puro se obtuvo en forma de aceite de color amarillo pálido, rendimiento 72%, [α] D20 = 17 ° (metanol), ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3) δ 7,38 - 7,19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8,1, 7,3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14,2, 8,2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14,2, 7,2 Hz, 1H).

3. Marcaje isotópico de alanina transaminasa Uso

En la síntesis de biblioteca combinatoria, especialmente en la síntesis de división-y-piscina de una perla un compuesto (OBOC) bibliotecas, la cantidad de compuesto que se puede obtener a partir de cada perla es relativamente pequeña. (Típicamente 1 pmol a 10 nmol). Además, la espectrometría de masas se utiliza ampliamente para la identificación y caracterización del compuesto final debido a su alta sensibilidad. Con el fin de utilizar la espectrometría de masas para determinar la estereoquímica absoluta en los centros quirales de los productos finales de la PTA, enantiómeros de ácido bromo deben ser IsotoPically etiqueta antes de usar. A continuación se describe el procedimiento de uso de las transaminasas y D ₂ O a la etiqueta L-alanina.

1. Disolver-L-alanina (300 mg, 3,36 mmol) con 10 ml de _D2O en un tubo de polietileno de 50 ml. Añadir α-cetoglutarato (10 mg, 0,068 mmol) como co-sustrato. Caliente el tubo a 37 ° C y ajustar el pD a 8.5 a 8.7 utilizando un soution 1 M NaOD. Nota: PD es determinada por las tiras de prueba de pH. Tradicional metros electro pH equipado con electrodo de vidrio selectivo para H ⁺ puede dar incorrecta leer para D ^+.
2. Añadir transaminasa alanina (0,1 mg, EC 2.6.1.2 del corazón de cerdo, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) a la DP 8.5 a 8.7, 37 ° C la solución preparada en el paso anterior. Poner el tubo en un 37 ° C incubadora y se incuba durante la noche con agitación suave, se prefiere de 10 a 30 rpm.
3. Después de la incubación durante toda la noche, tomar 0,5 ml de la solución D O ₂ y comprobar el progreso de la reacción por ^1H-RMN. Todas las señales de protones de unlanina, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), ¹ H RMN 400 MHz, debe ser suprimida en gran medida debido a la deuteración. Más de 98% del protón debe ser intercambiado a deuterio como se ha descrito previamente ^23. Nota: D ₂ O pueden ser parcialmente recuperada por destilación, si la reacción se lleva a cabo en gran escala (> 200 ml D ₂ O). Normalmente, 60% a 80% de _D2O puede ser destilada de la solución.
4. Congelar la solución anterior con nitrógeno líquido y liofilizar utilizando un liofilizador para obtener blanco deuterado polvo de L-alanina.

4. Síntesis de peptoide vinculador Región

La región de engarce no es necesaria para la síntesis de la biblioteca de PTA. Sin embargo, con el fin de evitar el alto fondo en el intervalo de peso molecular inferior (100-600) de la espectroscopia de masas MALDI y para mejorar la ionización de los compuestos, se utiliza a menudo un enlazador peptoide con múltiples residuos polares. Esta peptoide linker puede sintetizarse mediante el procedimiento de síntesis peptoide estándar. Aquí vamos a sintetizar un pentámero de glicina N-metoxietilo como el enlazador (como se muestra en la Figura 5).

1. Swell 90 micras perlas TentaGel con enlazador de RAM (1 g, 0,27 mmol / g) en 10 ml de DMF durante 3 h en un reactor de jeringa de 12 ml con agitación suave.
2. Vaciar el DMF del reactor y añadir solución de DMF de piperidina 10 ml de 20% para desproteger el grupo Fmoc de la amida de Rink enlazador. Agitar las perlas con la solución de piperidina al 20% durante 30 min. Lavar con DMF 5x para eliminar todo piperidina.
3. Tómese unos granos fuera de la jeringa y probarlo con la prueba de cloranilo. Cuentas deben dar vuelta a marrón oscuro (ensayo de cloranilo positivo para amina primaria) si fmoc se desprotege con éxito.
4. Preparar las siguientes soluciones: 1. 20 ml, solución 2 M de ácido bromoacético / DMF; 2 20 ml, solución 2 M DIC / DMF.; 3. 10 ml, 1 M de solución de methoxylethylamine / DMF.
5. Añadir 5 ml de solución 2 M de ácido bromoacético / DMF paralas perlas, sacuden suavemente. A continuación, añadir 5 ml de solución 2 M de DIC / DMF a las perlas; sellar la jeringa con el émbolo y lo puso en la coctelera. Agitar durante 10 min.
6. Lavar las perlas con DMF a fondo. Añadir 2 ml de solución 1 M metoxietilamina / DMF preparados a partir de paso 4,4 a las perlas. Selle la jeringa con el émbolo y agite en el agitador durante 30 min.
7. Lave las perlas con DMF 5x. Revise algunas cuentas con la prueba de cloranilo, si positivas (perlas se vuelven azules), y luego continuar con el siguiente paso. De lo contrario, repita el paso 4.6.
8. Repita los pasos 4.5 hasta 4.7, 4 veces para completar el pentámero.

. 5 Split-and-pool Síntesis de la Biblioteca de la PTA con (R) - y (S)-2-bromo-propiónico Ácidos

Aquí se describe la síntesis de una pequeña biblioteca PTA con una diversidad teórica de 9.261 compuestos utilizando el 1 g de cuentas desde el paso 4.8. Tenga en cuenta que un cordón TentaGel 90 micras contiene aproximadamente 2,9 millones de cuentas por gramo; Por lo tanto, la redundancia dela biblioteca será de 2,9 x 10 ^6/9261 = 312 copias. Vamos a utilizar ácido bromoacético, (R)-2-bromopropanoico y la etiqueta isotópica (S)-2-bromopropanoico ácido _d-4 como los ácidos, y 7 aminas diferentes (A1 ~ A7, véase la Figura 5 para los detalles) para la aminación. Reactores de jeringa y un colector de vacío se utilizan para realizar la síntesis.

1. Añadir 10 ml de 1:1 de DCM: DMF para la jeringa de la etapa 4.8; utilizar una pipeta de 1.000 l con una pipeta de punta truncada para dividir todos los cordones 1 g uniformemente en tres reactores 5 ml jeringa. Etiqueta como B (ácido bromoacético), R ((R)-2-bromopropanoico) y S ((S)-2-bromopropanoico ácido _d-4). Lave todas las 3 jeringas con DCM 3x, y lavar las jeringas marcadas con R y S con THF anhidro 3x, lavar la jeringa marcada con B con DMF 3x.
2. Jeringa R y S. Acoplamiento BTC de ácido bromopropanoico.
   1. Prepare una solución BTC / THF fresco. Añadir unaproximadamente 200 mg de BTC en el vial en una campana extractora, selle con la tapa. Pesar la cantidad de BTC en el vial. Calcular la cantidad de disolvente necesario y añadir THF anhidro en el vial para hacer una solución de 20 mg / ml de BTC / THF.
   2. Preparar los ácidos bromo / mezcla BTC. Añadir (R)-2-bromopropanoico ácido (89 l, 0,95 mmol) y (S)-2-bromopropanoico ácido _d-4 (89 l, 0,95 mmol) en dos pequeños viales por separado. Para cada vial, añadir 5 ml de la solución de 20 mg / ml de BTC / THF anteriormente. Selle los dos viales y ponerlos en -20 ° C congelador durante 20 min.
   3. Añadir 1125 l, 02:01 THF / DIPEA (750 l de THF, 375 l de DIPEA, 2,2 mmoles) a la jeringa R y S por separado. Mezcle los gránulos con la punta de la pipeta. Deje que repose durante 5 min.
   4. Tomar los dos enfrió ácidos bromo / mezclas BTC desde el paso 5.2.2, añadir 2,4,6-trimetilpiridina (356 l, 2,7 mmol) para cada uno viales. Precipitados blancos formarán inmediatamente. Aplicar la suspensión correspondiente directamentea las perlas se basificó (jeringa R y S en el paso 5.2.3) tan pronto como sea posible y luego ponerlos en un agitador a temblar por debajo de 120 rpm durante 2 horas.
      Nota: La solución de los reactores de la jeringa debe ser una suspensión amarillenta pálida durante todo el curso de la reacción. Un color más oscuro es una indicación de exceso de calor liberado durante la adición inicial de la solución de cloruro de ácido. Esto puede ser resuelto por un enfriamiento adicional o diluir los ácidos bromo / mezcla de BTC.
3. Jeringa B. Acoplamiento de ácido bromoacético con CID
   1. Preparar un fresco 20 ml, solución de ácido bromoacético 2 M / DMF. Preparar una solución de 20 ml, 2 M DIC / DMF.
   2. Añadir 2 ml de solución 2 M de ácido bromoacético / DMF para la jeringa B, agite suavemente. Añadir 2 ml de solución 2 M DIC / DMF para la jeringa B, agite suavemente.
   3. Ponga la jeringa B en la misma coctelera como jeringa R y S , Agitar durante 2 horas. Tenga en cuenta que la reacción de acoplamiento de ácido bromoacético / DIC se realiza dentro de 30 min; tiempo de reacción prolongado es para la conveniencia de la síntesis de división y de la piscina.
4. Después de 2 horas, tome la jeringa R, S y B de la coctelera. Lave los tres jeringas completamente con DCM 5x. Entonces lavar con DMF 5x. Tenga en cuenta que la jeringa R y S no pueden ser lavados con DMF antes de ser lavada con DCM o THF primero.
5. Piscina todos los granos de las jeringas R, S y B en un reactor de jeringa 12 ml. Lave todas las cuentas con DMF 5x.
6. Añadir 10 ml de 1:1 de DCM: DMF para la jeringa; utilizar una pipeta de 1.000 l con una pipeta de punta truncada para dividir todas las perlas en forma pareja en 7 individuales 2 ml jeringas, etiquetarlos como A1-A7.
7. Aminación. Preparar 10 ml, 2 soluciones de amina / DMF primarios M para cada uno de los 7 aminas enumeradas en la Figura 5. Añadir 5 ml de EACh solución de amina a la jeringa correspondiente A1-A7. Incubar todas las 7 jeringas en una incubadora de 60 ° C con agitación durante la noche.
8. Después de la incubación, lavar todas las cuentas a fondo con DMF. Tome algunas de cuentas de cada jeringa y comprobar con la prueba de cloranilo. Si las cuentas se vuelven verdes (positivo) a menos de 3 min, continúe con el próximo paso. Si es negativo, repita el paso 5.7 para las jeringas negativos.
9. Repita los pasos 5.1 a 5.8 2x para completar el trimer. Paso opcional: Después de cada ciclo, se recomienda comprobar la calidad de la síntesis mediante espectroscopía de masas tal como se describe a continuación. Todos los 9.261 compuestos están sintetizados en la perla TentaGel como biblioteca OBOC.
10. Misa de confirmación espectroscópica de los ACP.
    PTA son oligómeros altamente estructurados y poseen muchas características comunes de los péptidos N-metilados. Uno de los problemas comunes de síntesis en fase sólida de los péptidos N-metilado es la degradación de ácido durante la separación con TFA. Para suprimir la degradación del ácido, la escisión de moléculas como la ciclosporina desdesoporte sólido se lleva a cabo a menudo en condiciones de baja temperatura. Se compararon diversas condiciones de escisión para escindir moléculas diferentes PTA del soporte sólido. Hemos encontrado que, en general, baja temperatura y reducción de la concentración de TFA podrían reprimir eficazmente la degradación del ácido y proporcionar compuestos puros.
    1. Preparar 10 ml de solución 01:01 de TFA / DCM en un tubo de 15 ml. Selle el tubo y lo puso en un congelador de -20 ° C durante 20 min.
    2. Lavar las perlas que necesitan ser escindido con DCM 5x. Agitar las perlas en DCM durante 15 min y lavar las perlas de nuevo con DCM 5x.
    3. Escurrir el DCM de la jeringa. Utilice un microscopio de luz y una pipeta con la punta truncada para transferir cada cuenta individuo en una placa de 96 pocillos, una perla por pocillo.
    4. Cubrir la placa de 96 pocillos con un cubre. Poner la placa en un congelador de -20 ° C durante 15 min.
    5. Tome el 01:01 solución de TFA / DCM enfriado desde el paso 5.10.1 y añadir 20 l a cada uno de los pocillos que contiene un cordón. Coloque la hoja de la cubierta hacia atrás y put la placa de 96 pocillos en un agitador en el -20 ° C nevera.
    6. Agitar durante 20 min. Tome la placa de 96 pocillos y retire la hoja de la cubierta. Seque el TFA / DCM de cada pocillo soplando aire o argón sobre él. Si se escinden más de 10 granos, un SpeedVac se puede utilizar para secar el TFA / DCM de toda la placa. Tenga en cuenta que en este punto, no todos los compuestos se escinden de los granos, pero los compuestos escindidos debería ser más que suficiente para llevar a cabo el análisis de espectroscopia de masas.
    7. Añadir 20 l 6:04 de ACN: _H2O solución para disolver los compuestos escindidos de cada pocillo. Puntual 0,6 l de cada solución de compuesto junto con 0,6 l de matriz CHCA MALDI en la placa de MALDI.
    8. Utilice la espectrometría de masas MALDI para determinar el peso molecular y la secuencia (MS / MS) de cada compuesto.

6. Ensayo de cloranilo

1. Preparar los siguientes reactivos frescos para cada prueba. Solución A: 2% cloranilo (CAS: 118-75-2) en DMF. SoluciónB: 2% acetaldehído (CAS: 75-07-0) en DMF.
2. Mezclar 100 l de la solución A con 100 l de solución B antes de la prueba en un tubo de 1,5 ml; soltar los granos y agite suavemente. Si las perlas se vuelven azules dentro de 5 min, que indica la presencia de amina secundaria en la superficie de las perlas. Las aminas primarias dan un color marrón oscuro en lugar de azul girando.

Results

Aquí mostramos tres espectros MALDI representativas de un trímero PTA con enlazador. Como se muestra en la Figura 6A, cuando se escinde en condiciones de temperatura ambiente con solución de TFA / DCM al 50%, se observa una degradación significativa. En la figura 6A, el pico 593 y 484 se corresponden con el enlazador y el trímero PTA respectivamente, muestran que la molécula se sintetiza con éxito en grano pero degradó durante la segmentación. Cuando escindido bajo condiciones de baja t...

Discussion

Amidas terciarias de péptidos (ACP) son una superfamilia de oligómeros peptidomiméticas. Además de los péptidos bien estudiadas, peptoides y péptidos N-metilado, una gran parte de compuestos dentro de esta familia sigue siendo poco estudiada, mayormente debido a la falta de método sintético para acceder a los péptidos N-alquiladas generales. Aquí se describe un método eficiente para sintetizar las PTA con bloques de construcción quirales derivados de aminoácidos. Anteriormente, hemos informado a usar una nueva ruta sub-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6 trimetilpiridina	ACROS 161950010		CAS:108-75-8
2-morfolinoetanamina	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
Solución de agua al 48% HBr	ALFA AESAR		AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehído	Sigma-Aldrich		402788 CAS:75-07-0
Acetonitrilo	Fisher	SR015AA-19PS	CAS:75-05-8
Tetrahidrofurano anhidro (THF)	EMD	EM-TX0277-6	CAS:109-99-9
Benzilamina	Sigma-Aldrich	185701	CAS:100-46-9
bis(Triclorometilo) carbonato (BTC)	ACROS	258950050	CAS:32315-10-9
Ácido bromoacético	ACROS	106570010	CAS:79-08-3
Cloranilo	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
Ciclohexanemetilamina	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	Isótopo de Cambridge	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-Alanina	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
Diclorometano (DCM)	Fisher	BJ-NS300-20	CAS:75-09-2
Dimetilformamida (DMF)	Fisher	BJ-076-4	CAS:68-12-2
Etilenglicol	Madera de roble	44710	CAS:107-21-1
Isopentilamina	Sigma-Aldrich	W321907	CAS:107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS:7758-02-3
L-Alanina	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-metoxipropilamina	Sigma-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-metoxietilamina	Sigma-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-aminopropil)-2-pirrolidinona	Sigma-Aldrich	136565	CAS:7663-77-6
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC)	ACROS	115211000	CAS:693-13-0
N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)	Sigma-Aldrich	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD solución al 40% en agua	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
Piperidina	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS:110-89-4
Piperonilamina	Sigma-Aldrich	P49503	CAS:2620-50-0
Propilamina	Sigma-Aldrich	240958	CAS:107-10-8
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich		299537 CAS:76-05-1
α-Ácido ciano-4-hidroxicinámico	Sigma-Aldrich	39468	CAS:28166-41-8
&alfa;-Cetoglutarato	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS:328-50-7
Resina de Tentagel con enlazador RINK	Rapp-Polymere	S30023
Alanina transaminasa	Roche	10105589001	AKA: Glutamato-Piruvato Transaminasa (GPT)
Incubadora	New Brunswick Scientific	Innova44
NMR	Bruker	400 MHz
Espectrómetro de masas MALDI	Applied Biosystems	4800 MALDI-TOF/TOF
Liofilizador	SP	Scientific VirTis de sobremesa K
Reactor de jeringa	INTAVIS	Columna de reacción	3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Colector de vacío	Promega	A7231	Vac-Man