Artículo de método

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

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DOI:

10.3791/51302

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10 de junio de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Resumen

La mecánica microambiente se ha demostrado que actúa como un regulador crucial del comportamiento de crecimiento del tumor y de señalización, que es en sí remodelado y modificadas como parte de un conjunto de, interacciones de dos vías mechanosensitive complejos. Si bien el desarrollo de modelos de tumores en 3D biológicamente relevantes han facilitado estudios mecánicos sobre el impacto de la reología de la matriz en el crecimiento del tumor, el problema inverso de la cartografía de los cambios en el entorno mecánica inducida por tumores sigue siendo un reto. Aquí, se describe la aplicación de partículas de seguimiento de microrheology (PTM) en conjunción con modelos 3D de cáncer de páncreas como parte de un enfoque sólido y viable para el seguimiento longitudinalmente cambios físicos en el microambiente del tumor, in situ. La metodología descrita aquí se integra un sistema de preparación in vitro en modelos 3D incrustados en un modelo de matriz extracelular (ECM) andamio de colágeno de tipo I con sondas marcadas con fluorescencia distribuidos de manera uniforme para POsición y mediciones microrheology dependientes del tiempo a lo largo de la muestra. tumores in vitro están chapados y probaron en condiciones paralelas utilizando placas de imagen de múltiples pocillos. Sobre la base de los métodos establecidos, videos de los movimientos de la sonda de rastreo se transforman a través de la Relación Generalizado Stokes Einstein (GSER) para reportar el módulo de cizallamiento complejo viscoelástico dependiente de la frecuencia, G * (ω). Debido a que este enfoque es a base de formación de imágenes, caracterización mecánica también se proyecta sobre grandes campos espaciales de luz transmitida a reportar simultáneamente cambios cualitativos en el tamaño del tumor 3D y fenotipo. Los resultados representativos que muestran contraste respuesta mecánica en sub-regiones asociadas con degradación de la matriz localizada inducida por invasión-, así como la calibración del sistema, se presentan los datos de validación. También se presentan los resultados no deseados de los errores experimentales comunes y solución de problemas de estos temas. El formato de chapado cultura 3D de 96 bien implementado en este protocolo es conducive a la correlación de las mediciones microrheology con ensayos de cribado terapéuticos o de imagen molecular para obtener nuevos conocimientos sobre el impacto de los tratamientos o estímulos bioquímicos en el microambiente mecánico.

Introducción

Pues bien, de un creciente cuerpo de evidencia en la literatura que las células cancerosas, al igual que las células epiteliales de mamíferos no malignas, son muy sensibles a las propiedades mecánicas y biofísicas de la matriz extracelular circundante (ECM) y otros componentes del microambiente 1-9. Estudios mecánicos elegantes han proporcionado ideas sobre el papel de la rigidez extracelular como socio de señalización mechanosensitive complejo que regula el comportamiento maligno de crecimiento y la morfogénesis 2,3,10,11. Esta labor se ha visto facilitada en particular, por el desarrollo del 3D en modelos tumorales in vitro que restauran la arquitectura del tejido biológicamente relevante y se pueden cultivar en materiales de andamiaje con la mecánica sintonizables y imágenes de microscopía óptica 12-19. Sin embargo, el otro lado de este cuadro de diálogo mechanoregulatory entre el tumor y el microambiente, a través del cual las células cancerosas, a su vez modificar la reología de su entorno, sigue siendo algomás difíciles de estudiar. Por ejemplo, durante los procesos de invasión, las células en la periferia de un tumor pueden someterse a transición epitelial a mesenquimal (EMT) y aumentar la expresión de metaloproteasas de la matriz (MMPs) que causan la degradación local de la ECM 20-22, que a su vez influye en el comportamiento de crecimiento de mechanosensitive otras células tumorales proximal. A través de una variedad de procesos bioquímicos, células de cáncer de marcar continuamente la rigidez local de su entorno arriba y hacia abajo para adaptarse a diferentes procesos en diferentes momentos. La metodología descrita aquí está motivada por la necesidad de instrumentos de análisis que reportan los cambios locales en la rigidez y el cumplimiento de la MEC durante el crecimiento, que se pueden integrar con modelos de tumores en 3D y correlacionados longitudinalmente con cambios bioquímicos y fenotípicas sin interrumpir la cultura.

En busca de una técnica apropiada para aplicar en este contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) se perfila como un fuerte candidato.Este método, pionero originalmente por Mason y Weitz 23,24, utiliza el movimiento de las sondas de rastreo incrustados en un fluido complejo reportar el módulo complejo dependiente de la frecuencia de cizalla viscoelástico, G * (ω) a escalas de longitud de micras. Este enfoque general ha sido desarrollado con múltiples variaciones adecuadas para diferentes aplicaciones en-suaves de la Materia Condensada, coloides, la biofísica y la física de polímeros 25-31. PTM tiene ciertas ventajas con respecto a otros métodos, ya que las lecturas de la viscoelasticidad local son proporcionados por formación de imágenes de vídeo no destructivo de las sondas de trazador bioquímicamente inactivos que se incorporan en el momento de preparación de cultivo y permanecen en su lugar durante largos períodos de crecimiento. Esto está en contraste con las medidas estándar de oro con un reómetro de cizalla oscilatoria a granel, lo que necesariamente requiere la terminación de la cultura y de los informes de la reología macroscópica grueso de la muestra en lugar de mediciones puntuales dentro del complejo microenvir tumor 3DAMBIENTE. De hecho, un número de estudios han demostrado la utilidad de la interpretación de las mediciones de movimientos de la sonda trazador en o alrededor de las células cancerosas o no cancerosas para medir deformaciones asociadas con la migración celular 32, la tensión mecánica inducida por un esferoide expansión 33, reología intracelular 34,35, y para asignar cargas mecánicas en la ingeniería de tejidos 36, y la relación entre el tamaño de los poros y la velocidad de invasión 37. Otras técnicas adecuadas para microrheology, tales como la microscopía de fuerza atómica (AFM) se pueden implementar, pero principalmente para sondear los puntos en la superficie de la muestra y también pueden plantear problemas de esterilidad de la cultura que complican las mediciones longitudinales 38.

Aquí se describe un protocolo integral métodos para el crecimiento de esferoides tumorales 3D adecuados para su transferencia a ECM con sondas fluorescentes incrustados para vídeo partícula de seguimiento y análisis de métodos para mapear fiablemente espacial que abarcacambios en microrheology largo del tiempo en la cultura. En la presente aplicación, modelos de tumores 3D se cultivan en formato de múltiples pocillos con vistas a la incorporación de mediciones microrheology con otros ensayos tradicionales (por ejemplo, citotoxicidad) que este formato es propicio para. En esta ilustración representativa de esta metodología de cultivo in vitro esferoides 3D utilizando células PANC-1, una línea celular de cáncer de páncreas establecidos conocidos para formar esferoides 39, pero todas las mediciones descritas en este documento son ampliamente aplicables al estudio de tumores sólidos usando una variedad de líneas celulares adecuados para el cultivo en 3D. Debido a que este método se basa formación de imágenes de sí que es ideal para el co-registro de los datos microrheology alta resolución con grandes campos de luz transmitida de vista que informan de cambios en el crecimiento celular, la migración y el fenotipo. La implementación de PTM integrado con microscopía de luz transmitida de esta manera asume el posicionamiento reproducible de los qu platina del microscopioich suele estar disponible en los microscopios biológicos epifluorescencia widefield comercial motorizados. El protocolo desarrollado a continuación se puede implementar con cualquier microscopio biológico de fluorescencia automatizado razonablemente equipadas. Este es un método intensivo de datos inherente, lo que requiere la adquisición de gigabytes de datos de microscopía de vídeo digitales para el procesamiento fuera de línea.

En el siguiente protocolo, Protocolo 1 se refiere a la preparación inicial de esferoides tumorales que se describe aquí el uso de superposición en agarosa, pero podría estar sustituidos con una variedad de otros métodos tales como la gota que cuelga 40, o cultivo rotatorio 41 técnicas. Protocolo 2 se describe el proceso de integración de esferoides en una estructura de colágeno, aunque, alternativamente, in vitro tumores en 3D podrían ser cultivadas mediante encapsulación o la incrustación de células resuspendidas en ECM 12,15, en lugar de esferoides no adherentes individuales pre-formadas. Protocolos posteriores describen procedimientos para obtaining mediciones microrheology tiempo de resolverse mediante la adquisición y procesamiento de datos de microscopía de vídeo, respectivamente. El procesamiento de datos se describe utilizando MATLAB, haciendo uso de las rutinas de código abierto para el PTM construido en algoritmos descritos originalmente por Crocker y Grier 42, que también se han desarrollado ampliamente para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semana / idl /).

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Protocolo

1. Esferoides tumorales cultivo

  1. Mezclar 10 ml de agua de grado de cultivo de células con 0,1 g de agarosa para obtener una solución de agarosa al 1%.
  2. Solución de agarosa de calor por encima de 70 ° C (más o menos 14 segundos en un horno de microondas estándar o mediante el uso de una placa de calentamiento) antes de alícuotas de 40 l de solución de agarosa en un pocillo en una placa de 96 pocillos.
  3. Incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 h mientras la cosecha de las células utilizando técnicas estándar.
  4. Utilice un hemocitómetro para determinar la concentración de células en la suspensión.
  5. Diluir la suspensión de células a 1000 células / ml y añadir 100 l de esta dilución a la bien que contiene el lecho de agarosa curado.
  6. Colocar la muestra en un agitador durante la noche en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2.
  7. Quitar la muestra de coctelera y añadir 100 ml de medio de cultivo celular.
  8. Incubar esferoides hasta que se alcanza el diámetro deseado. Por ejemplo, después de 9 días, un spHeroid habrá aproximadamente 450 m de diámetro. Durante este tiempo, el medio de crecimiento fresco puede ser añadido a los pozos de aspiración, pero se debe evitar ya que esto resultará en la eliminación del esferoide.

2. Preparación esferoides tumorales 3D incrustados en ECM

  1. Preparar una estación de trabajo con los materiales necesarios dentro de una campana de flujo laminar.
  2. Prepare una mezcla diluida de 1 m de diámetro sondas trazadores fluorescentes modificado carboxilato añadiendo sondas 2 piezas de stock (2% de sólidos) a 25 partes de agua estéril.
  3. Quitar una botella de 3,1 mg / ml de colágeno bovino de la nevera y colóquelo sobre hielo.
  4. Alícuota de 125 l de colágeno en un vacío vial de 2 ml.
  5. Añadir 50 l de solución de sonda de trazador diluido al vial que contiene el colágeno y agitar brevemente para distribuir sondas.
  6. Añadir 235 l de medio de cultivo celular apropiado que contiene rojo de fenol (que se convertirá amarillo) para un volumen total de 410 ml y agitar brevemente antes de retirar 205 ml (la mitad del volumen total) y colocándolo en un nuevo vial de 2 ml. Vial 1 contendrá el esferoide tumoral y Vial 2 será una mezcla de control.
  7. Añadir ~ 2 l de 1 M de NaOH al vial 1 para llevar la solución de nuevo a pH neutro (medios de cultivo que contienen rojo de fenol deben volver a rojo). Tenga en cuenta que esto hará que la mezcla para iniciar el curado si no se mantiene en hielo. Vortex brevemente para mezclar, y luego volver a una rejilla de hielo inmediatamente.
    NOTA: El esferoide es apenas visible a simple vista después de 9 días de cultivo y su retirada de la cama de agarosa es una tarea delicada. El uso de un microscopio de disección puede ser útil para algunos usuarios. El mantenimiento de la integridad del esferoide durante la transferencia es de suma importancia.
  8. Con una punta de pipeta de boca ancha, retire suavemente 40 l de los medios de comunicación desde el pozo que contiene el esferoide tumor. Conserve este 40 l, mientras que la realización de la siguiente etapa.
  9. Compruebe el pozo para ver si el esferoidefue eliminado en el paso anterior. Si lo fuera, añadir los 40 l que contenía el esferoide al vial 1. Si no, coloque los 40 l atrás en el bien y repita el paso anterior.
  10. Revuelva suavemente Vial 1 (no se arriesgue a vórtex, se puede dañar el esferoide) antes de transferir la mezcla en 60 porciones mu l en tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccionar cada pocillo con un microscopio después de la adición de la mezcla para determinar que bien contiene el esferoide.
  11. Añadir ~ 2 l 1 M de NaOH y 40 l de medios de cultivo celular a Vial 2 y un vórtex antes de alícuotas 60 l de esta mezcla a un vacío bien en la placa de 96 pocillos y etiquetado como control.
  12. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C para curar durante al menos 1 hora.

3. Construir rejilla de puntos muestrales y Tomar un video en cada punto

  1. Transfiera la placa de la muestra de la incubadora a la platina del microscopio. Permita 10 minutos para que la muestra equilibrate con la temperatura ambiente si una etapa caliente no está disponible.
  2. Observar la muestra con lentes de objetivo de baja potencia para asegurarse de que está intacto y listo para la imagen. Determinar la posición del tumor dentro del pozo.
  3. Decida cuántos puntos de muestra a tomar. Por lo general, 20 puntos de muestreo en cada pocillo, distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide producirán resultados debidamente detalladas.
  4. Mueva el escenario para cada posición deseada y utilice el microscopio interfaz de software para registrar las coordenadas X e Y (o registro de las coordenadas manualmente en caso de interface de software no está disponible).
  5. Encienda el microscopio a una lente de objetivo de alta potencia (típicamente 100X), y seleccione el cubo de filtro apropiado para la longitud de onda de excitación de las sondas de rastreo. Use la lista de puntos creados en el paso 3.4 para mover al primer punto de la cuadrícula.
  6. Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pozo, y luego moverse hacia arriba para encontrar un campo de visión (FOV) que contiene varios trac de enfoqueer sondas.
  7. Observe el histograma de intensidad y ajustar la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible al tiempo que garantiza que la imagen no se convierte en saturada.
  8. Obtener una secuencia de vídeo a una velocidad de 20 a 30 milisegundos por cuadro (aproximadamente 800 marcos o 16-24 segundos de longitud se recomienda para proporcionar estadísticas suficientes para el cálculo MSD robusta equilibrio con la necesidad de reducir al mínimo el tiempo de adquisición en cada punto de la malla espacial) y guardar con una convención apropiada. Durante la grabación, no toque el microscopio o una mesa.
  9. Repita los pasos 3.6 hasta 3.9 por cada punto de muestra en la cuadrícula.
  10. Repita los pasos 3.3 a 3.10 para cada pozo en el experimento.

4. Análisis de los datos de vídeo para Calcular Propiedades reológicas en cada punto de muestra

  1. Copie todos los datos de vídeo a una carpeta de análisis (posiblemente en un equipo diferente).
  2. Importar datos de imagen en MATLAB u otro software de análisis.
    NOTE: Amplia documentación relativa al conjunto de MATLAB rutinas de seguimiento de partículas adoptadas aquí está disponible en http://people.umass.edu/kilfoil . Se recomienda el uso de una función de llamada personalizados para automatizar el procesamiento de múltiples archivos en diferentes posiciones.
  3. Calibrar el software mediante el análisis de varios fotogramas de vídeo para determinar adecuadamente los parámetros de selección y rechazo (tamaño, de paso de banda, etc) para la identificación de las posiciones del centro de la sonda. Amplia fondo de estos pasos cruciales es descrito por Crocker y Grier.
  4. Utilice el software para determinar automáticamente cada posición de la sonda para todos los fotogramas de vídeo y luego vincular estas posiciones en las trayectorias.
  5. Utilice los datos de trayectoria para calcular la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) como una función del tiempo de retraso, asegurándose de aplicar el factor de calibración espacial apropiada (m por píxel) para la lente de objetivo específico, cualquier pixel binning, etc (típicamente llevadoen los metadatos).
  6. Calcular G * (usando la generalizada relación de Stokes-Einstein tienen en cuenta los límites de aplicabilidad de GSER para una determinada muestra de 24,28,43. Alternativamente, los usuarios pueden querer interpretar propiedades ECM directamente desde MSD simplemente comparando la escala de ley de potencia, meseta valores, índices de heterogeneidad u otros parámetros.
  7. Repita los pasos 4.2 a 4.6 por cada fov en el experimento.
  8. Co-registro de datos de posición desde el paso 3.4 con modulii viscoelásticas a una frecuencia particular de interés. Dependiendo del fabricante del microscopio utilizado, este paso puede ser facilitada por una rutina personalizada que lee los metadatos microscopio o posición de los datos pueden ser tabulados manualmente.
  9. Uso de las funciones de interpolación 3D para generar un mapa de la reología espacial de la ECM.

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Resultados

Para verificar la validez de G * (ω) mediciones en las posiciones localizadas dentro de un complejo microambiente tumoral modelo, se realizaron dos experimentos iniciales de validación. En primer lugar, hemos tratado de validar nuestras medidas contra el "estándar de oro" de reometría cizalla oscilatoria granel. Hemos preparado muestras idénticas de matriz de colágeno (sin células) a una concentración de 1,0 colágeno mg / ml. Estas muestras se probaron con un reómetro mayor (TA Instruments AR-G2, util...

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Discusión

En este protocolo se introduce una estrategia sólida y de aplicación general para el seguimiento longitudinal cambios locales en la rigidez ECM en modelos de tumores en 3D. Tenemos la visión de que esta metodología podría ser adoptada por los biólogos del cáncer y biofísicos interesados ​​en el comportamiento mechanosensitive implicados en la remodelación de la matriz durante el crecimiento del tumor y de los procesos de invasión. La cuantificación precisa de la cinética de degradación de la matriz podría ser particular...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos la compartición de código abierto de MATLAB código partícula de seguimiento proporcionado por Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), junto con el código IDL antes y una extensa documentación proporcionada por John C. Crocker y Eric R. Weeks. Este trabajo fue posible gracias al financiamiento del Instituto Nacional del Cáncer (NCI / NIH), K99CA155045 y R00CA155045 (PI: JPC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colágeno bovino tipo 1BD Biosciences, San José, CA354231
PANC-1Cultivo celular de tipo americano, Manassas, VACRL1469u otro tipo de célula apropiado
Microesferas fluorescentesTechnologies, Carlsbad, CA906906
MatrigelBD Biosciences, Bedford, MA354230
Pescador de agarosa Biorreactivos, Waltham, MAC12H18O9
NaOHFisher Bioreagents, Waltham, MANC0480985
Placas de imagen de 96 pocillosCorning Inc., Corning, NY3904
DMEMHyclone, Waltham, MASH30243.01o medios de cultivo celular
apropiados Zeiss Microscopio AxioObseverZeiss, Oberkochen, AlemaniaIncluye cámara de alta velocidad y software de imagen
software MATLABThe Mathworks, Natick, MA
Life

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